蘇靜，王桂蘭，趙儀英，余利巖，劉紅宇

冷凍干燥保藏法，是目前被廣泛采用的一種較理想的保藏方法。文獻(xiàn)報道一般保藏時間達(dá) 5 ～ 15 年，所以傳代轉(zhuǎn)種的間隔是 5 ～ 10 年。國內(nèi)尚未有保藏時間超過 30 年的文獻(xiàn)報道。本文將 1972 – 1979 年間采用冷凍干燥法保存的 120 株菌種復(fù)壯，發(fā)現(xiàn)此法保藏的菌株經(jīng)過 32 ～39 年的保存，總存活率高達(dá) 83.3%。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 鏈霉菌屬（Streptomyces）53 個種116 株、游動放線菌屬（Actinoplanes）1 株、諾卡菌屬（Nocardia）2 株、鏈輪絲菌屬（Streptoverticillium）1 株，均來源于本所藥用微生物菌種保藏中心。

1.1.2 傳代斜面[1]高氏一號培養(yǎng)基為廣東環(huán)凱微生物科技有限公司產(chǎn)品；ISP2 培養(yǎng)基為碧迪醫(yī)療器械（上海）有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 冷凍干燥保存法[2-4]冷凍干燥保藏法是用保護(hù)劑制備擬保藏菌種的細(xì)胞或孢子懸液于安瓿管中，在低溫下（低于共晶點(diǎn) 10 ～ 20 ℃）將菌懸液凍結(jié)，并減壓抽真空，使水升華將樣品脫水，形成完全干燥的固體菌塊。然后在真空條件下融封，造成無氧真空環(huán)境，置 4 ℃ 低溫下，使微生物處于休眠狀態(tài)，而得以長期保藏。保護(hù)劑通常為 10%脫脂牛奶。

1.2.2 菌種復(fù)壯 用 70% 酒精棉花擦拭安瓿上部，將安瓿管頂部燒熱，用無菌棉簽蘸冷水，在頂部擦 1 圈，頂部出現(xiàn)裂紋后，用鑷子在裂紋部輕叩一下，敲下已開裂的安瓿管的頂端，用滅菌水溶解菌塊，使用無菌吸管吸取菌懸液涂布于高氏一號和 ISP2 斜面培養(yǎng)基上，于 28 ℃ 培養(yǎng) 25 d。觀察斜面，有 1 個及以上菌落生長視為該菌存活。

2 結(jié)果

把從 1972 – 1979 年保存的菌種按照冷凍干燥保藏法的復(fù)壯方法進(jìn)行全面復(fù)壯，觀察其菌絲生長情況。共檢測接種放線菌 120 株，其中的 80 株可以產(chǎn)生各種生理活性物質(zhì)。120 株菌株中有游動放線菌屬 1 株，存活 32 年；諾卡菌屬 2 株，均存活 34 年以上；鏈輪絲菌屬 1 株，存活32 年；鏈霉菌屬 53 個種，116 株，其中 96 株存活32 年以上，總存活率高達(dá) 83.3%（表 1）。

表 1 放線菌保藏 32 ～ 39 年后存活情況

續(xù)表 1

續(xù)表 1

3 討論

在使用冷凍干燥法保藏菌種的過程中，影響菌種存活率的因素很多，如菌種差異，保藏前使用的培養(yǎng)基，菌種的生長狀況，保護(hù)劑、凍干曲線是否合適，凍干后的存放地點(diǎn)，復(fù)壯條件等。藥用微生物菌種保藏中心從 20 世紀(jì) 60 年代末開始采用冷凍干燥技術(shù)保藏放線菌。從上述的存活性實(shí)驗結(jié)果可以看出，采用冷凍干燥法長期保藏放線菌是十分有效的。

在冷凍干燥法的過程中嚴(yán)格控制冷凍干燥保藏的各個環(huán)節(jié)，可以延長菌種保藏時間，提高保藏效率。特別是以下幾個環(huán)節(jié)值得注意：

⑴選擇易產(chǎn)孢培養(yǎng)基，盡可能縮短待凍干菌種于4 ℃ 冰箱放置時間。

⑵設(shè)定合適的凍干曲線。由于過去的小型凍干機(jī)層板溫度和真空度無法控制，不能保證樣品在主凍干過程中，溫度始終低于共晶點(diǎn) 10 ～ 20 ℃，造成菌種不能完全在升華狀態(tài)下被抽干水分，影響菌種的保藏效果。目前，本中心正在對冷凍干燥整個流程的各個環(huán)節(jié)進(jìn)行質(zhì)量控制，購置了中試型凍干機(jī)，全面控制凍干曲線[4]，以延長微生物菌種保藏時間。

[1] Zhang JZ. Microbial taxonomy. Shanghai: Fudan University Press,1990:153-154. (in Chinese)張紀(jì)中. 微生物分類學(xué). 上海: 復(fù)旦大學(xué)出版社, 1990:153-154.

[2] Tokio NEI. Microbial preservatio method. Jin LY, Translation.Shanghai: Shanghai Scientific and Technical Publishers, 1982:5-7. (in Chinese)根井外喜男. 微生物保存法. 金連緣, 譯. 上海: 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 1982:5-7.

[3] Institute of microbiology culture collection manual preparation group. Culture collection manual. Beijng: Science Press, 1980:615-616. (in Chinese)中國科學(xué)院微生物研究所菌種保藏手冊編制組. 菌種保藏手冊.北京: 科學(xué)出版社, 1980:615-616.

[4] John GD, Glyn NS. Cryopreservation and freeze-drying protocols(Methods in molecular biology). 2nd Ed. Totowa, New Jersey:Humana Press, 2007.