何涌泉，孟哲峰，張曉燕

上海市(復(fù)旦大學(xué)附屬)公共衛(wèi)生臨床中心，上海 201508

盡管高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療(highly active antiretroviral therapy, HAART)抗人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染較成功，但其只能抑制(suppression)體內(nèi)病毒，要完全清除(eradication)病毒仍是一個(gè)遙遠(yuǎn)的目標(biāo)，主要原因是病毒潛伏庫(latent viral reservoir)的存在[1]。病毒潛伏庫是指在體內(nèi)免疫系統(tǒng)和外來藥物的高壓下，病毒選擇隱藏于宿主的細(xì)胞或解剖學(xué)場所(一般位于二級淋巴結(jié)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、睪丸等部位)。對HIV感染者來說，此時(shí)的病毒不復(fù)制或只有低水平復(fù)制能力，通常的抗病毒治療方法無法有效攻擊潛伏庫中的病毒。而一旦停止用藥，潛伏庫的病毒將有機(jī)會(huì)再次復(fù)制和擴(kuò)增，導(dǎo)致體內(nèi)病毒載量迅速反彈[2]。因此，深入研究HIV潛伏庫的形成機(jī)制，有助于探索有效的病毒潛伏庫清除或控制方法，減緩艾滋病疾病進(jìn)展，提升臨床抗病毒治療的效果。

1 HIV潛伏感染的形成

當(dāng)進(jìn)入宿主細(xì)胞后，HIV通過將病毒RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA形成整合前復(fù)合體(preintegration complex, PIC)，整合到宿主基因組后，多數(shù)成為前病毒(provirus)，隨宿主細(xì)胞基因組復(fù)制而產(chǎn)生子代病毒。小部分則由于所在宿主細(xì)胞處于G0期而潛伏，只有受某種刺激后才重新開始復(fù)制。這種細(xì)胞非常少，大約占整個(gè)外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)總數(shù)的百萬分之一，卻是HIV難以根除的關(guān)鍵原因。

潛伏形成后，HIV大致有3種存在形式：一種是以PIC的形式存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，并未整合入細(xì)胞核內(nèi)，該狀態(tài)下PIC可能會(huì)被細(xì)胞降解，然而一旦細(xì)胞在PIC降解之前被活化，會(huì)導(dǎo)致HIV整合與復(fù)制；第2種是PIC進(jìn)入細(xì)胞核，但沒有整合到人類基因組內(nèi)，而是在核內(nèi)呈游離狀態(tài)，大多數(shù)通過重組形成只有一個(gè)長末端重復(fù)序列(long terminal repeat, LTR)區(qū)的1-LTR HIV環(huán)，極少部分在DNA連接酶作用下將兩端LTR連接形成類似質(zhì)粒結(jié)構(gòu)的2-LTR HIV環(huán)[3, 4]；第3種是成功將自己整合進(jìn)人類基因組中[5]，但概率很低。雖然HIV形成這3種狀態(tài)的機(jī)制不相同，但都成功逃避了宿主免疫系統(tǒng)攻擊及藥物清除，與細(xì)胞共生；同時(shí)，這些細(xì)胞一般都處于G0期，為靜息細(xì)胞，一旦受抗原、細(xì)胞因子等刺激，會(huì)成為效應(yīng)細(xì)胞，使病毒具有復(fù)制活性并產(chǎn)生病毒顆粒(圖1)。

病毒潛伏的形成可能與染色體的結(jié)構(gòu)變化有關(guān)系。有研究發(fā)現(xiàn)，核小體在其中扮演重要角色。當(dāng)HIV DNA整合進(jìn)常染色質(zhì)時(shí)，nuc-0、nuc-1和nuc-2會(huì)被其5′ LTR包裹，由于這些核小體與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)重疊，阻止轉(zhuǎn)錄因子接近，使轉(zhuǎn)錄無法進(jìn)行。轉(zhuǎn)錄激活蛋白(transactivator protein, Tat)能結(jié)合染色質(zhì)改構(gòu)復(fù)合物SWI/SNF，使染色體結(jié)構(gòu)變化，暴露出相應(yīng)位點(diǎn)而進(jìn)行轉(zhuǎn)錄[6, 7]。SWI/SNF在HIV潛伏周期中所發(fā)揮作用的具體機(jī)制尚不明確。

圖1 HIV-1 DNA基因整合及調(diào)控示意圖Fig.1 Genome integration and regulation schematic diagram of HIV-1 DNA

不同的核因子κB( nuclear factor κB，NF-κB)/Rel家族在維持HIV-1潛伏中也起重要作用。P50蛋白能招募組蛋白去乙?；傅紿IV-1的LTR區(qū)，促進(jìn)染色質(zhì)凝聚并抑制RNAPolII靠近[8, 9]。在白細(xì)胞介素7(interleukin 7，IL-7)誘導(dǎo)的記憶CD4+T細(xì)胞自我更新時(shí)，低水平NF-κB分子活化及T細(xì)胞受體(T cell receptor，TCR)信號通路均能促進(jìn)bcl-2、bclxl等抗凋亡基因表達(dá)[8]。此外，IκB激酶能磷酸化轉(zhuǎn)錄因子FOXO3a，阻斷對凋亡基因的誘導(dǎo)[10, 11]。這些分子的混合作用使記憶CD4+T細(xì)胞長久生存，并維持病毒潛伏庫的存在。

2 HIV潛伏庫的細(xì)胞來源

HIV潛伏庫有2種來源，一種是HIV DNA未整合入人類基因組，而是游離于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中，尤其是游離于細(xì)胞核中的1-LTR HIV和2-LTR HIV能進(jìn)行穩(wěn)定的低水平復(fù)制[12]。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，抑制整合酶可增加細(xì)胞內(nèi)2-LTR HIV比例，最多可達(dá)600拷貝/100萬PBMC。另一種是完全整合的細(xì)胞庫，有較高的穩(wěn)定性和隱蔽性，是完全清除HIV感染的主要障礙。由游離HIV DNA組成的潛伏庫在病毒復(fù)制中扮演主要角色，由于一直保持著低水平復(fù)制活性，在停止治療后，可能會(huì)通過激活細(xì)胞來喚醒其余HIV[4]。

HIV潛伏的細(xì)胞包括記憶CD4+T細(xì)胞、純真CD4+T細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞[5]、自然殺傷細(xì)胞及多功能造血干細(xì)胞等[13]。其中記憶CD4+T細(xì)胞的2種亞型是潛伏庫最主要的部位，分為中央記憶T細(xì)胞(central memory T cell)和過渡性記憶T細(xì)胞(transitional memory T cell)。大部分HIV潛伏于中央記憶T細(xì)胞，但過渡性記憶T在體內(nèi)存在的時(shí)間更長且不斷更新[5]。這些潛伏細(xì)胞來源大概分為3類：一類為感染的效應(yīng)細(xì)胞存活下來并轉(zhuǎn)化為記憶細(xì)胞；一類是在各種趨化因子作用下HIV直接感染純真CD4+T細(xì)胞等而形成；最后一類則是由潛伏細(xì)胞繁殖或分化形成[14-16]。

3 HIV潛伏庫的清除

HIV潛伏庫的控制主要涉及整合酶抑制劑的應(yīng)用、潛伏病毒的識別、潛伏病毒的激活及病毒潛伏細(xì)胞激活后的識別等。主要采用組蛋白去乙酰化酶抑制劑(histone deacetylase inhibitor, HDACi)、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)調(diào)節(jié)劑、甲基化抑制劑等激活潛伏病毒復(fù)制，使之暴露于外源性抗病毒藥物及免疫系統(tǒng)攻擊之下。

3.1 HDACi

染色質(zhì)的組蛋白乙?；腿ヒ阴；钦{(diào)節(jié)基因表達(dá)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而異?；虮磉_(dá)是遺傳和代謝疾病發(fā)生的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。組蛋白的乙酰化程度由組蛋白乙?；负腿ヒ阴；竻f(xié)調(diào)控制[17]。組蛋白的乙?；芨淖?nèi)旧w結(jié)構(gòu)，使轉(zhuǎn)錄因子接近HIV LTR區(qū)域而啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄活動(dòng)；而組蛋白去乙?；改苷{(diào)節(jié)染色體構(gòu)象，抑制基因表達(dá)，有利于HIV處于潛伏狀態(tài)。

第1個(gè)通過美國食品藥品管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)審查的HDACi藥物是伏立諾他(vorinostat)，即辛二酰苯胺異羥肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid, SAHA)，用于治療皮膚T細(xì)胞淋巴癌。雖然SAHA會(huì)引起體內(nèi)DNA損傷，但能被正常細(xì)胞修復(fù)[18, 19]；同時(shí)，在長期接受SAHA刺激的細(xì)胞中沒有觀察到DNA突變[20]。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該藥物能在不活化細(xì)胞的情況下激活HIV復(fù)制活性，使病毒感染細(xì)胞能被免疫系統(tǒng)或藥物識別并清除[21]。目前，已有文獻(xiàn)為SAHA作為藥物使用提供了“概念型”(proof-of-concept)的依據(jù)，該實(shí)驗(yàn)采用分離自持續(xù)治療患者的靜息CD4+T細(xì)胞，證明SAHA能有效激活HIV RNA表達(dá)，且體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示增加SAHA濃度(200 mg→400 mg)時(shí)機(jī)體表現(xiàn)出良好的耐受能力[20]。但在其他實(shí)驗(yàn)中觀察到，CD4+T潛伏細(xì)胞活化后不會(huì)因?yàn)镠IV復(fù)制而引發(fā)由病毒導(dǎo)致的細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect, CPE)，也不會(huì)被普通CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)識別并清除，只能被經(jīng)特殊抗原刺激過的CD8+CTL清除[22]。而體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，HIV特異性的CD8+T細(xì)胞所介導(dǎo)的清除對HIV潛伏細(xì)胞識別程度并不高，其殺傷能力也有所下降[23]。因此，對CD8+T細(xì)胞殺傷機(jī)制的研究有助于理解清除HIV潛伏細(xì)胞的方式。

目前，帕比司他(panobinostat)、恩替諾特(entinostat)及ITF2357(givinostat)等HDACi藥物正以治療癌癥為目的進(jìn)行2期或3期臨床試驗(yàn)。最近研究表明，在HIV潛伏的T細(xì)胞模型中，這些藥物都能激活潛伏HIV的復(fù)制，其中ITF2357能減少CD4+T細(xì)胞CXCR4和CCR5的表達(dá)[24]。還有一些新開發(fā)的HDACi在體外實(shí)驗(yàn)中能激活潛伏HIV的活性，包括MCT-1、MCT-3、CG05和CG06，但需更多、更深入的動(dòng)物模型來驗(yàn)證。

3.2 PKC調(diào)節(jié)劑

PKC能通過多種方法啟動(dòng)HIV轉(zhuǎn)錄。首先，PKC可活化轉(zhuǎn)錄因子NF-κB來誘導(dǎo)HIV轉(zhuǎn)錄，PKC激活后將誘導(dǎo)NF-κB的抑制蛋白IκB-α磷酸化和不完全降解，使NF-κB與IκB解離，解離出來的NF-κB與HIV LTR區(qū)的多個(gè)位點(diǎn)結(jié)合，使轉(zhuǎn)錄進(jìn)行。其次，PKC能激活活化蛋白1(activator protein 1，AP-1)，使其與HIV啟動(dòng)子結(jié)合。最后，通過促進(jìn)Tat轉(zhuǎn)錄因子與細(xì)胞反式激活應(yīng)答(trans-activation response，TAR)元件結(jié)合，促使HIV轉(zhuǎn)錄開始[25-27]。

體外實(shí)驗(yàn)中，酪氨酸激酶抑制劑(prostratin)不僅通過激活PKC而激活潛伏HIV的復(fù)制，還能與HDACi類藥物發(fā)揮良好的協(xié)同作用[28]。半合成酪氨酸激酶抑制劑已研制成功[29]，但酪氨酸激酶抑制劑不能特異性針對HIV產(chǎn)生激活作用，目前也缺乏臨床數(shù)據(jù)來證明其功效。

作為酪氨酸激酶抑制劑結(jié)構(gòu)類似物的格尼迪木任(又稱尼地嗎啉, gnidimacrin)，是從瑞香狼毒中分離得到的二萜類化合物[30]，目前主要作為抗腫瘤藥物進(jìn)行研究。有研究表明，其能在部分細(xì)胞系中展現(xiàn)出比酪氨酸激酶抑制劑更高的激活病毒復(fù)制的能力，也能通過下調(diào)CCD5表達(dá)來抑制R5病毒株感染[31]。但其在MT4細(xì)胞系中的表現(xiàn)不太理想，同時(shí)抑制的病毒株過于單一，是否能擴(kuò)大作用范圍，包括細(xì)胞系、病毒株等，仍缺乏實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

最近發(fā)現(xiàn)苔蘚抑素(bryostatin)能激活PKC和AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)途徑以再度激活潛伏HIV的DNA[25]，尤其當(dāng)其與CD4抗體包裹形成納米顆粒后，能高效定位到CD4+T細(xì)胞并激活潛伏病毒[32]。

PKC抑制劑如卡馬拉素(rottlrein)能抑制PKCθ在T細(xì)胞中表達(dá)，最終抑制HIV復(fù)制[33]。然而對該類藥物的研究不多，能否應(yīng)用于臨床還有待進(jìn)一步評估。

3.3 甲基化抑制劑

DNA甲基化是指DNA甲基轉(zhuǎn)移酶將S-腺苷甲硫氨酸的甲基轉(zhuǎn)移給胞嘧啶的過程。研究表明，DNA甲基化是維持HIV潛伏的主要機(jī)制之一。在HIV 5′ LTR的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)有2處CpG島甲基化修飾序列，抑制轉(zhuǎn)錄因子接近目標(biāo)DNA的啟動(dòng)子[34]，使HIV進(jìn)入潛伏狀態(tài)。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(DNA methyltransferase inhibitor，DNMTi)可能具有激活HIV的能力。有資料表明，記憶CD4+T細(xì)胞中出現(xiàn)大量過度甲基化情形，而靜息CD4+T細(xì)胞沒有該現(xiàn)象發(fā)生[35]。這可能因?yàn)榧谆前l(fā)生在HIV-1 DNA整合之后并加強(qiáng)基因沉默效果的機(jī)制，而非推動(dòng)HIV-1在核細(xì)胞內(nèi)主動(dòng)進(jìn)入潛伏期。

最近對5-脫氧氮雜胞苷(5-aza-2′-deoxycytidine, 5-Aza-dC)的研究表明，該藥物在不同細(xì)胞系中發(fā)揮不同作用[36]。當(dāng)5-Aza-dC與HDACi共同作用分離自HARRT治療患者的CD4+T細(xì)胞時(shí)，顯示有高效激活作用。因此，需對該類藥物進(jìn)行更多的HIV甲基化研究，從而明確其特異作用靶點(diǎn)，有效識別HIV DNA重組位點(diǎn)，為HIV潛伏庫清除研究提供科學(xué)依據(jù)。

3.4 位點(diǎn)特異性重組

位點(diǎn)特異性重組是遺傳重組的一類，該重組發(fā)生僅需一小段同源序列即特異性位點(diǎn)(又稱附著點(diǎn)，attachment site，att)和識別該位點(diǎn)的特異重組酶參與，并不需要Rec蛋白[37]。當(dāng)一段基因存在2個(gè)特異位點(diǎn)時(shí)，根據(jù)這2個(gè)位點(diǎn)方向，重組酶能決定位點(diǎn)之間DNA發(fā)生整合、倒位、易位或切除的4種結(jié)果。當(dāng)特異位點(diǎn)方向相同，位點(diǎn)之間的DNA將發(fā)生易位、整合或切除；當(dāng)特異位點(diǎn)方向相反，則發(fā)生DNA倒位。其中，切除和倒位由于動(dòng)力學(xué)原因更易發(fā)生[38]。目前研究者期望通過在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)一種能特異識別HIV序列的重組酶，敲掉整合到人類基因組的HIV DNA。

研究發(fā)現(xiàn)，噬菌體P1的Cre/loxP體系的識別位點(diǎn)與HIV LTR區(qū)具有相似性。Sarker等因此構(gòu)建了Tre/loxLTR體系，通過新構(gòu)建的Tre重組酶(Tre-recombinase)識別一段34對堿基序列的loxLTR區(qū)域[39]。目前研究使用從HIV Tat中分離的一段蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(protein transduction domain, PTD)肽段[40]或從乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)PreS2蛋白分離的一段細(xì)胞滲透轉(zhuǎn)運(yùn)基序(cell-penetrating translocation motif)作為載體[41]，將Tre轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)細(xì)胞。雖然在細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)中獲得較高效率，能有效將HIV DNA從基因組清除[42]，但目前并沒有更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)其在體內(nèi)的效果，且Tre重組酶的活性仍是個(gè)問題。

3.5 細(xì)胞因子

細(xì)胞因子被提出作為HIV治療藥物已有15年歷史。目前加強(qiáng)對HIV感染者免疫效率的研究更關(guān)注于多種細(xì)胞因子的聯(lián)合使用，包括IL-2、IL-7、IL-15等。單一細(xì)胞因子或作用微弱，或靶細(xì)胞太少，無法發(fā)揮較為全面的療效。其中占主要地位的可能是IL-7，這是因?yàn)镮L-7比IL-2更能增強(qiáng)HIV的復(fù)制活性，且單獨(dú)使用IL-2可使調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell, Treg)增殖并抑制CD8+T細(xì)胞的活化和殺傷能力[43]。IL-7能誘導(dǎo)來自患者PBMC中的HIV復(fù)制。在SCID-hu小鼠實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在病毒治療期使用最大劑量IL-7(>10 μg/kg)，能檢測到明顯的病毒信號(viral blip)[44]。但在部分體外實(shí)驗(yàn)中，IL-7僅表現(xiàn)出微弱效果，這可能與HIV感染的不同細(xì)胞系有關(guān)，且IL-7可能增加血清中HIV RNA含量[45]。IL-15能通過誘導(dǎo)記憶細(xì)胞分化來激活HIV的復(fù)制活性，但具體應(yīng)用仍面臨諸多問題，包括誘導(dǎo)強(qiáng)度、靶細(xì)胞單一等。

4 結(jié)語

HIV潛伏庫清除藥物研究中的問題大致有兩方面：一是無法做到特異性識別；二是激活效率不高。大多數(shù)機(jī)制是直接通過表觀遺傳學(xué)的方法進(jìn)行活化，或活化T細(xì)胞，或活化沉默基因，無法特異性識別HIV DNA結(jié)合位點(diǎn)。而位點(diǎn)特異性重組雖能識別HIV DNA結(jié)合位點(diǎn)，但效率較低，可供參考的數(shù)據(jù)不多。作為最新研究HIV潛伏機(jī)制的熱點(diǎn)，微小RNA(microRNA)最近多次出現(xiàn)在各種艾滋病大會(huì)議程中，但大多數(shù)研究尚處于進(jìn)展之中，未見相關(guān)發(fā)表文章，故不敘述。

目前，研究HIV如何長期存在于HARRT治療中的患者，有了不少進(jìn)展，但完全清除潛伏庫中的感染細(xì)胞或病毒仍是難題。雖然已有不少藥物在體外展現(xiàn)良好的作用，部分藥物甚至已批準(zhǔn)用于治療其他疾病，但沒有足夠數(shù)據(jù)證明其在HIV感染者中能發(fā)揮相應(yīng)的活性。

采用聯(lián)合用藥清除體內(nèi)HIV是最好的選擇，因?yàn)樵絹碓蕉嗟淖C據(jù)表明，一個(gè)有效的治療方法不僅在于對潛伏HIV的激活，還在于對HIV潛伏細(xì)胞的識別清除[46]。應(yīng)首先證明這些藥物在體內(nèi)能有效針對潛伏細(xì)胞產(chǎn)生作用，而這需更多臨床試驗(yàn)及相應(yīng)資金支持。因此，HIV潛伏庫是治療HIV感染中不能逃避的問題，同時(shí)也是最大的挑戰(zhàn)。

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