胡迪超 張愛華 楊曉明 (武漢生物制品研究所有限責任公司，武漢430060)

IL-2通過與IL-2R結(jié)合而發(fā)揮其生物學功能。高親和力的IL-2R由α(Tac，CD25)、β和γ三條異源多肽鏈組成。αβγ、βγ和α與IL-2的親和力分別為10-11、10-9和 10-8mol/L，可見只有當 IL-2與CD25結(jié)合后才能使得IL-2與IL-2R達到最大的親和力，因此CD25在介導IL-2生物學功能的過程中發(fā)揮重要作用。CD25分子是由251個氨基酸殘基組成的分子質(zhì)量約為55 kD的跨膜糖蛋白，從細胞膜上脫落的可溶性CD25分子約為44 kD。CD25分子高表達于許多自身免疫病、同種移植排斥反應和多種淋巴瘤的T細胞表面［1］。

以CD25分子為靶標的治療性抗體Basiliximab和Daclizumab在腎臟移植排斥反應中發(fā)揮了重要作用。起初，Binder等［2］采用噬菌體文庫篩選法表明Basiliximab和Daclizumab識別CD25分子上的表位為D2區(qū)的116～122(ERIYHFV)位殘基。但Du等［3］采用結(jié)構(gòu)生物學分析法表明Basiliximab識別CD25分子上幾個不連續(xù)的片段，包括D1區(qū)1～6、21～29、38～48和56～57位殘基以及D2區(qū)118～120殘基共23個氨基酸殘基。而Yang等［4］采用結(jié)構(gòu)生物學分析法表明Daclizumab也識別CD25分子上幾個不連續(xù)的片段，包括D1區(qū)1～6、25～27和42～43位殘基以及D2區(qū)118～120和149～155位殘基共21個氨基酸殘基。由于它們所識別的表位與IL-2識別的表位很多都重疊，因而能夠阻斷IL-2的生物學功能。Basiliximab與CD25的親和力為1×10-10mol/L，而采用Scatchad法測定Daclizumab與CD25的親和力為1/3×10-9mol/L，其親本抗體為1/9×10-9mol/L。鑒于此，本研究構(gòu)建了具有自主知識產(chǎn)權(quán)的CD25嵌合抗體穩(wěn)定細胞株并對表達產(chǎn)物進行相關(guān)鑒定。

1 材料與方法

1.1細胞株、菌株及質(zhì)粒 CHO-DHFR-由本室保存;Top 10感受態(tài)細胞購自天根生化科技(北京)有限公司;含有抗人CD25嵌合抗體基因的表達質(zhì)粒pOptiVEC-TacH和pcDNA3.3-TacL由本人前期構(gòu)建并保存(宿主細胞為 Top 10);含有質(zhì)粒pUC57-VP163的宿主菌由本室保存。

1.2主要試劑 PrimeSTAR?HS DNA Polymerase with GC Buffer購自寶生物工程(大連)有限公司;質(zhì)粒小量、中量提取試劑盒購自Qiagen公司;FastDigest?EcoR Ⅰ 和 FastDigest?XhoⅠ 購自 Fermentas公司;LigaFast Rapid DNA Ligation System購自Promega公司;IMDM培養(yǎng)基、透析FBS、IgG超低FBS、Opti-MEM?Reduced Serum Media、LipofectamineTM2000和 Geneticin購自 Invitrogen公司;HT media supplement、甲氨蝶呤(MTX)和FITC標記的山羊抗人IgG(Fc specific)多抗為Sigma公司產(chǎn)品;Cy5標記的山羊抗小鼠IgG(H+L)多抗購自abcam公司;TRITC標記的山羊抗人Kappa鏈多克隆抗體購自SouthernBiotech公司;人源細胞表達的重組人IL2Rα(CD25)胞外段Met 1-Cys 213購自北京義翹神州生物技術(shù)有限公司;5層細胞工廠(3 180 cm2)為Corning公司產(chǎn)品;1 ml HiTrap Protein A HP預裝純化柱為GE公司產(chǎn)品。

1.3相關(guān)引物 VPP1：5＇-CGGAATTCAGCGCAG AGGCTTGGGGCAGCCGAG-3＇(EcoRⅠ);VPP2：5＇-TGGTGGCGGCGGTTTCGGAGGCCGTCCGGGGC-3＇;V5H3：5＇-CCTCCGAAACCGCCGCCACCATGGAATGTAAC-3＇;V5H4：CCG CTCGAGAGCTCATTTACCCGGAGACAGG G-3＇(XhoⅠ);V5L3：5＇-GCCTCCGA AACCGCCGCCACCATGGTGTCCTCT-3＇;V5L4：5＇-CCG CTCGAGAGCTCAACACTCTCCCCTGTTGAAGC-3＇(XhoⅠ)。

1.4細胞培養(yǎng) 使用含100 μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基篩選和培養(yǎng)含有目的基因的工程菌;使用含100 μmol/L次黃嘌呤和 16 μmol/L胸腺嘧啶(HT)的IMDM培養(yǎng)基(含10%FBS)常規(guī)培養(yǎng)CHODHFR-細胞;抗CD25嵌合抗體穩(wěn)定細胞株的篩選和培養(yǎng)使用含500 μg/ml Geneticin的IMDM培養(yǎng)基(無HT)進行選擇性培養(yǎng)。

1.5抗人CD25嵌合抗體穩(wěn)定表達質(zhì)粒的構(gòu)建以質(zhì)粒pUC57-V163為模板，用引物VPP1和VPP2擴增含有VP163序列的基因片段;并分別以pOptiVEC-TacH和 pcDNA3.3-TacL為模板，以引物V5H3和V5H4以及V5L3和V5L4擴增含有重、輕鏈序列的基因片段;反應條件均為98℃變性10秒，58℃(5個循環(huán))、56℃(5個循環(huán))、54℃(10 個循環(huán))和52℃(10個循環(huán))均退火5秒，每個循環(huán)72℃延伸均為90秒;凝膠純化回收目的基因片段后分別將含有VP163的基因片段與含有重、輕鏈的基因片段按一定比例混合，按98℃變性10秒、68℃保溫90秒循環(huán)10次;然后分別補加引物VPP1和V5H4以及VPP1和V5L4，按上述反應條件擴增VTacH和VTacL片段，但循環(huán)完畢繼續(xù)72℃保溫5分鐘;使用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切質(zhì)粒以及目的基因片段，純化回收后在T4 DNA連接酶的作用下進行連接，轉(zhuǎn)化Top 10后采用菌落PCR鑒定陽性克隆并進行測序鑒定。

1.6抗人CD25嵌合抗體穩(wěn)定細胞株的構(gòu)建 用Pvu I內(nèi)切酶分別將質(zhì)粒pOptiVEC-VTacH和pcDNA3.3-VTacL進行線性化;然后使用Opti-MEM分別稀釋質(zhì)粒DNA和Lipofectamine 2000并按一定比例制備質(zhì)粒DNA：脂質(zhì)體復合物，轉(zhuǎn)染生長狀態(tài)良好的CHO-DHFR-細胞并繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)48小時后，使用含500 μg/ml Geneticin但不含HT的IMDM培養(yǎng)基(10%透析FBS)進行選擇性培養(yǎng)，約14天后使用有限稀釋法篩選表達水平高的克隆;分別以100、200、300、400和500 nmol/L MTX進行初次加壓篩選，待細胞在該條件下恢復生長良好狀態(tài)后繼續(xù)增加100 nmol/L MTX直至抗體表達水平不再增高。

1.7抗人CD25嵌合抗體的表達及才純化 將CD25嵌合抗體穩(wěn)定細胞株擴大培養(yǎng)，以約1×105ml-1接種于5層細胞工廠，培養(yǎng)6～8天后更換為經(jīng)優(yōu)化的無血清培養(yǎng)基，并繼續(xù)培養(yǎng)6～9天進行表達;收獲細胞上清液，經(jīng)離心、過濾和超濾濃縮后使用1 ml Protein A純化目的抗體;然后使用BCA法(Pierce)對抗體濃度進行定量。

1.8激光共聚焦法檢測CD25嵌合抗體的穩(wěn)定表達 將連續(xù)傳代3個月以上的CD25嵌合抗體細胞株進行細胞爬片，預冷PBS清洗3次后用80%冷丙酮-20℃固定20分鐘，預冷PBS洗滌3次(5分鐘/次)后分別使用TRITC標記的山羊抗人Kappa鏈多抗(1∶1 000)、FITC 標記的山羊抗人 IgG-Fc(1∶64)多抗和Cy5標記的山羊抗小鼠IgG(H+L)多抗(1∶5 000)進行標記，然后用預冷PBS洗滌3次并使用注射用水沖洗一次，完畢用激光共聚焦顯微鏡(Leica公司)進行觀察。

1.9質(zhì)譜法對抗人CD25嵌合抗體進行鑒定 使用還原型SDS-PAGE將CD25嵌合抗體的重、輕鏈分開，0.1 μg/μl胰蛋白酶消化后使用基質(zhì)輔助激光解析離子化串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF/TOF，德國Bruker公司)分析，將獲得的數(shù)據(jù)輸入Mascot肽質(zhì)量指紋圖譜數(shù)據(jù)庫進行檢索分析。

1.10蛋白質(zhì)N端氨基酸測序法對抗人CD25嵌合抗體進行鑒定 使用還原型SDS-PAGE將CD25嵌合抗體和親本抗體WuTac的重、輕鏈分開，然后分別將目的蛋白片段進行蛋白質(zhì)N端氨基酸測序(ABI公司)，此過程委托上?；瞪锛夹g(shù)有限公司完成。

1.11抗人CD25嵌合抗體平衡解離常數(shù)(Kd)的測定 取黑色96孔板，第1列全部加入200 μl PBS(0.01 mol/L，pH7.4);第2 列全部加入 200 μl抗體溶液(25 μg/ml);第3列全部加入200 μl SD 溶液(0.01 mol/L PBS，pH7.4，0.02%Tween 20，0.1%BSA);第4列第1～7孔分別加入200 μl重組CD25抗原溶液(10、5、2.5、1.25、0.625、0.313 和 0.156 μg/ml)，第8孔加入200 μl SD溶液;第5列全部加入200 μl SD溶液;CD25嵌合抗體用抗人IgG-Fc傳感器(AHC)進行捕獲;WuTac單抗用抗鼠IgG-Fc傳感器(AMC)進行捕獲;然后在Octet RED系統(tǒng)(ForteBio)內(nèi)按PBS平衡60秒、捕獲抗體600秒、SD平衡180秒、結(jié)合600秒和解離1 800秒程序進行結(jié)合和解離測定;完畢使用Octet軟件計算Kd值。

2 結(jié)果

2.1采用重疊延伸PCR法分別在質(zhì)粒pOptiVECTac-H和pcDNA3.3-Tac-L抗體表達框內(nèi)添加VP163序列，瓊脂糖凝膠電泳表明成功進行了拼接，見圖1;菌落PCR均鑒定出陽性克隆并進行序列測定，結(jié)果表明成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達質(zhì)粒VEC-VTac-H和3.3-VTac-L。

圖1 重疊延伸PCR結(jié)果Fig．1 Overlap PCR products analyzed by agarose gel electrophoresis

2.2將線性化的質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CHO-DHFR-細胞并經(jīng)歷選擇性培養(yǎng)后，采用有限稀釋法篩選表達水平高的克隆，結(jié)果見圖2;然后采用逐步提高MTX濃度的方法進行加壓篩選，最終獲得的穩(wěn)定細胞株抗體表達水平約為3.74～7.07 μg/ml(3～4天)，MTX濃度為600～800 nmol/L。

2.3擴大培養(yǎng)抗CD25嵌合抗體穩(wěn)定細胞，待5層細胞工廠內(nèi)達到一定細胞密度后采用優(yōu)化后的無血清培養(yǎng)基進行表達;將1 900 ml表達上清離心、過濾、超濾濃縮后使用Prtoein A純化目的抗體，結(jié)果見圖3;BCA蛋白定量法測得抗體總量為16.08 mg，因此CD25嵌合抗體的表達水平為8.46 mg/L。

2.4激光共聚焦檢測結(jié)果表明所有表達CD25嵌合抗體的細胞均能呈現(xiàn)紅色、綠色和藍色熒光，這表明抗CD25嵌合抗體基因在宿主細胞內(nèi)穩(wěn)定表達人的恒定區(qū)和鼠的可變區(qū)，結(jié)果見圖4;而對照細胞(正常CHO-DFHR-)未發(fā)現(xiàn)有紅色和綠色熒光，但出現(xiàn)較弱的藍色熒光(數(shù)據(jù)未給出)，這可能是由于Cy5標記的抗鼠抗體與CHO-DFHR-細胞存在一定的交叉反應。

圖2 克隆篩選的ELISA檢測結(jié)果(×100)Fig．2 Screening for high-level expression clones identified by sandwich ELISA(×100)

圖3 抗CD25嵌合抗體親和層析圖Fig．3 Affinity chromatogram ofchimeric antibody against CD25 molecule

2.5質(zhì)譜分析檢索結(jié)果表明CD25嵌合抗體重鏈均能檢索到與之匹配的鼠源和人源抗體片段，輕鏈也能檢索到與之匹配的人源抗體片段，但只能檢索到鼠源性成分，而未能檢索到匹配的鼠源性抗體片段，這可能由于數(shù)據(jù)庫中還未收集與其輕鏈鼠源性可變區(qū)相似的抗體質(zhì)量指紋，質(zhì)譜檢索結(jié)果見表1。

2.6蛋白質(zhì)N端氨基酸測序結(jié)果表明CD25嵌合抗體(chTac)的N端氨基酸序列與DNA序列推導的氨基酸序列完全一致，這也與親本抗體WuTac的N端氨基酸序列完全一致(見表2和圖5)，且信號肽在預期的位點進行了剪切(SignalP 3.0，數(shù)據(jù)未給出)。

2.7以傳感器分別捕獲CD25嵌合抗體和WuTac，通過結(jié)合與解離不同濃度重組CD25抗原，采用Octet軟件進行曲線擬合并分別計算出CD25嵌合抗體的Kon(1/Ms)和Kdis(1/s)為5.90×105和1.39×10-4，其 Kd值為2.35×10-10mol/L;而 WuTac的 Kon(1/Ms)和Kdis(1/s) 為1.30×106和2.45×10-4，其KD值為1.88×10-10mol/L。

表2 CD25嵌合抗體和WuTac單抗N端測序結(jié)果Tab．2 The N-terminal sequencing results of WuTac and chTac

圖4 激光共聚焦檢測結(jié)果Fig．4 Stable expression o f chimeric antibody against CD25 molecule observed by confocal microscopy

表1 肽質(zhì)量指紋檢測結(jié)果Tab．1 The results of peptide mass fingerprint

圖5 蛋白質(zhì)N端氨基酸測序峰圖(第1個氨基酸)Fig．5 The sequencing graph of N-terminal amino acid of WuTac and CD25 chimeric antibody by Edman degradation method(The first amino acid)

3 討論

當前抗CD25嵌合抗體Basiliximab和人源化抗體Daclizumab在器官移植排斥反應中發(fā)揮著重要作用，并具有治療腫瘤和自身免疫病的潛力。為了研發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的CD25治療性抗體，采用重組DNA技術(shù)對本所構(gòu)建的WuTac進行了人鼠嵌合改造。前期研究表明其保留了親本抗體的抗原結(jié)合特異性［5］。為了進一步確證其保留了親本抗體的結(jié)合特異性性和親和力，本研究構(gòu)建了CD25嵌合抗體穩(wěn)定細胞株并對表達產(chǎn)物開展了進一步鑒定。

VP163為鼠VEGF 5＇UTR的一段序列，其可能有增強目的蛋白表達的作用，因此本研究將其插入CD25嵌合抗體重、輕鏈的表達框內(nèi)。由于使用BCA法定量抗體時使用的標準品為BSA，與IgG為不同類蛋白質(zhì)，同種濃度下鼠IgG的OD值為BSA的1.18，而人IgG為其1.09，因而在計算抗體濃度時對數(shù)據(jù)進行了校正以使其更接近真實值。為了評估CD25嵌合抗體細胞株的穩(wěn)定性，本研究采用了激光共聚焦法對抗體基因在細胞內(nèi)的表達進行了檢測，同時也采用ELISA法對抗體的分泌水平進行了連續(xù)監(jiān)測以及對基因組DNA和總mRNA進行了PCR鑒定(數(shù)據(jù)未給出)。質(zhì)譜分析結(jié)果表明CD25嵌合抗體含有鼠源性成分和人源性成分。為了評估CD25嵌合抗體的抗原結(jié)合特異性，本研究采用Western blot、Dot blot和流式細胞術(shù)對純化的抗體進行了檢測(數(shù)據(jù)未給出)。蛋白質(zhì)N端氨基酸測序表明CD25嵌合抗體與WuTac的N端氨基酸序列完全一致，且信號肽在預期位點被成功剪切掉。由于測定KD值時本身存在一定的允許誤差，因而可以認為CD25嵌合抗體與親本抗體WuTac的親和力無明顯差異。

綜上所述，所構(gòu)建的嵌合抗體保留了親本抗體的抗原結(jié)合特異性和親和力，從而為研發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的CD25治療性抗體打下了堅實基礎(chǔ)。

致謝:感謝湖北大學生命科學院、武大大學基礎(chǔ)醫(yī)學院及武漢病毒研究所在儀器設(shè)備上提供的幫助。

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2 Binder M，Vogtle F N，Michelfelder S et al．Identification of their epitope reveals the structural basis for the mechanism of action of the immunosuppressive antibodies basiliximab and dalizumab［J］.Cancer Res，2007;67(8)：3518-3523.

3 Du J，Yang H，Zhang D et al．Structural basis for the blokage of IL-2 signaling by therapeutic antibody basiliximab ［J］.J Immunol，2010;184(3)：1361-1368.

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5 胡迪超，張愛華，楊曉明et al.抗人CD25嵌合抗體基因的構(gòu)建及其瞬時表達研究［J］.中國免疫學雜志，2011;27(7)：648-653.