雷玉艷 張 晨 汪幸思 曹 婷 林 爽 王莎莎 艾熱提艾山 瓦哈埔·馬木 夏夢(mèng)菊梁少華 劉榮輝 (新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院，烏魯木齊030011)

自20世紀(jì)70年代發(fā)現(xiàn)ApoE以來(lái)，ApoE等位基因多態(tài)性與冠心病(Coronary heart disease，CHD)相關(guān)性的研究日益增多。ApoE等位基因多態(tài)性是影響血漿脂蛋白與心血管疾病的重要遺傳易感因素，CHD是一種受飲食、遺傳和環(huán)境等多因素影響的疾病，發(fā)病存在種族差異［1］，相關(guān)研究已很多，但維、哈兩民族對(duì)照研究尚未見(jiàn)，本文則就新疆維、哈兩民族ApoE等位基因多態(tài)性與冠心病關(guān)聯(lián)性研究報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象 長(zhǎng)期生活在新疆地區(qū)的具有一定民族代表性的維、哈兩民族411人。正常人組：新疆喀什地區(qū)與阿勒泰的維吾爾族、哈薩克族正常人共198例。維吾爾族98例，平均年齡27歲，男性占42%，大專以上文化程度占89%;有高血壓病家族史者為7%。哈薩克族100例，平均年齡21.3歲，男性占18%，大專以上文化程度占100%，42%有高血壓病家族史，其中高血壓病合并冠心病家族史者6例，有糖尿病家族史的為1%。

冠心病組：共213人。2010年冠脈造影確診的新疆喀什地區(qū)維吾爾族冠心病人105例，平均年齡56.62歲，女性占52%，男性占48%，女性患者多于男性;大專以上文化程度者占22% 。有冠心病、高血壓病家族史者占7.6%。48%甘油三酯大于正常;76.2%高密度脂蛋白低于正常值;50.5%低密度脂蛋白高于正常值;90%超敏c反應(yīng)蛋白陽(yáng)性。

2011年符合冠心病診斷標(biāo)準(zhǔn)的新疆阿勒泰地區(qū)，伊犁地區(qū)哈薩克族冠心病住院病人108例，平均年齡64.3歲，男性占59.26%，大專以上文化程度占12.02%。有冠心病、高血壓病家族史者占14.8%;甘油三酯異常13.9%;膽固醇升高8.3%;5.6%高密度脂蛋白低于正常值;90%低密度脂蛋白高于正常值。

1.2方法

1.2.1DNA提取 ApoE基因型的測(cè)定：采集維、哈兩民族冠心病人和正常人空腹血液標(biāo)本，ACD抗凝，蛋白酶 K 消化后，酚-氯仿抽提提取 DNA［2］;利用SNaPshot SNP分型技術(shù)對(duì)所得411個(gè)樣本進(jìn)行2個(gè)SNP位點(diǎn)分型。具體實(shí)驗(yàn)步驟：①電泳DNA樣本對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量檢查以及濃度的估計(jì);②PCR反應(yīng)：PCR 引物，rs429358_rs7412F：GGCGCGGACATGGAGGAC;rs429358_rs7412R：GCCCCGGCCTGGTACACT。反應(yīng)體系(20 μl)包含 1 × GC Buffer I，3.0 mmol/L Mg2+，0.3 mmol/L dNTP，1 U HotStarTaq polymerase(Qiagen Inc.)，1 μl樣本 DNA 和 2 μl多重PCR引物。再對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。③SNaP-shot多重單堿基延伸反應(yīng)：延伸引物，rs429358SF：CGCGGACATGGAGGACGTG;rs7412SF：TTTTTTTTT TTTTTTTTTTTGCCGATGACCTGCAGAAG。延伸反應(yīng)體系 (10 μl) 包 括 5 μl SNaPshot Multiplex Kit(ABI)，2 μl純化后多重 PCR 產(chǎn)物，1 μl延伸引物混合物，2 μl超純水。④純化后得到的延伸產(chǎn)物在ABI3130XL基因分析儀上進(jìn)行測(cè)序。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有資料采用美國(guó)SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)和方差齊性檢驗(yàn)，率的檢驗(yàn)用χ2分析，其他統(tǒng)計(jì)量用方差分析和多元逐步回歸分析。

2 結(jié)果

2.1兩民族基因頻率對(duì)比 維、哈兩民族對(duì)照組與冠心病組之間，冠心病與冠心病組之間E2、E3、E4各單倍體、各基因型陽(yáng)性率居于相同水平(P＞0.05)。E2可能與頻數(shù)太少有關(guān)，見(jiàn)表1。

2.2兩民族基因頻率與內(nèi)地漢族對(duì)比 新疆維、哈兩民族ApoE等位基因頻率接近歐洲種群與內(nèi)地漢族完全不同，E4頻率高于內(nèi)地漢族與日本。

2.3兩民族血脂檢測(cè)結(jié)果 維吾爾族高密度脂蛋白76.2%(80/105)低于正常值;低密度脂蛋白50.5%(53/105)高于正常值;甘油三酯47.6%(50/105)高于正常;膽固醇僅16.1%(17/105)高于正常。而哈薩克族血脂各項(xiàng)指標(biāo)異常者未超過(guò)15%。維吾爾族發(fā)病年齡明顯早于哈薩克民族，P＜0.05。

3 討論

ApoE等位基因與冠心病、血脂、動(dòng)脈硬化的關(guān)系已不斷被人們研究和認(rèn)識(shí)。國(guó)內(nèi)外許多流行病學(xué)研究都已證實(shí)E4是冠心病(Coronary heart disease，CHD)發(fā)病的危險(xiǎn)因素，不論男性或女性ApoE基因攜帶者患CHD的危險(xiǎn)性上升，E4攜帶者比不帶E4者患 CHD 的危險(xiǎn)性顯著增加［3，4］。而 E2等位基因的作用是降低膽固醇濃度，對(duì)冠狀動(dòng)脈硬化的發(fā)展有防護(hù)作用，Yang等［5］研究也發(fā)現(xiàn)冠狀動(dòng)脈硬化病CAD患者中，E2等位基因頻率顯著低于對(duì)照組。但Stengard 等［6］持否定觀點(diǎn)。

ApoE是一種富含精氨酸的堿性蛋白質(zhì)，主要存在于CM、VLDL、IDL和部分HDL中，有利于這些載脂蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，正常人血漿 ApoE濃度為0.03～0.05 g/L。ApoE的濃度與血漿甘油三酯含量呈正相關(guān)，在參與脂質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)、儲(chǔ)存、利用及排泄中起著重要的作用。王景華等［7］報(bào)道在健康人群中，E2有降低甘油三酯(TG)和(低密度脂蛋白)LDL的作用，而E4有升高TG的作用。

表1 新疆維哈兩民族冠心病組及對(duì)照組APOE基因型及等位基因頻率Tab．1 Uighurs and kazaks in Xinjiang CHD group and control group in APOE gene type and the allele frequency

本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：新疆哈薩克族與維吾爾族兩民族之間ApoE等位基因頻率無(wú)顯著性差異，陽(yáng)性率亦居于相同水平(P＞0.05)。而105例維吾爾族冠心病人中76.2%的患者高密度脂蛋白水平低于正常值，50.5%低密度脂蛋白高于正常值;47.6%甘油三酯高于正常;16.1%膽固醇高于正常。哈薩克族冠心病人組有冠心病、高血壓病家族史者占14.8%，血脂異常者未超過(guò)15%，但哈薩克對(duì)照組中42%有高血壓病家族史。說(shuō)明發(fā)病可能與飲食、生活習(xí)性、工作性質(zhì)及其他遺傳因素有關(guān)。維吾爾民族飲食中食肉品種相對(duì)單一，主要以羊肉為主，脂肪含量相對(duì)較高，更要注意調(diào)節(jié)飲食。改變生活方式已被證實(shí)是一種費(fèi)效比較好的降低心血管疾病危險(xiǎn)的方法［8］。在冠心病發(fā)生的諸多因素中，年齡、性別、遺傳是無(wú)法控制的，但我們可以經(jīng)過(guò)自己的努力，采取措施改掉一些可以克服的因素，如吸煙、過(guò)量飲酒、高能量飲食、懶惰、易激動(dòng)、過(guò)勞等習(xí)慣，定期檢查身體，就會(huì)大大減少冠心病發(fā)生的可能。哈薩克族高血壓病發(fā)病率高，工作性質(zhì)以游牧為主，因此冠心病的一級(jí)預(yù)防應(yīng)從年輕時(shí)就開(kāi)始，減弱遺傳帶來(lái)的不利影響。E2差異無(wú)法顯現(xiàn)可能與頻數(shù)太少有關(guān)。其他基因型可能與兩民族對(duì)照組平均年齡只有21、27歲，與冠心病組相差太多有關(guān)。對(duì)照年齡與病例組年齡越接近，影響因素越單純，可能越有顯著性意義。

目前，國(guó)內(nèi)外不少研究者對(duì)冠心病及ApoE進(jìn)行基因多態(tài)性分析，盡管所用的方法學(xué)基本相同，但結(jié)論并不一樣。造成這種現(xiàn)象的主要原因無(wú)外乎［7］：(1)樣品數(shù)量太少和/或等位基因頻率太低;(2)可能與人群選擇、疾病診斷以及種族和地區(qū)差異有關(guān)。(3)選擇標(biāo)準(zhǔn)及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法不同等，本組均能說(shuō)明。除此以外，更多的是由于未能認(rèn)識(shí)疾病多樣表型的重要意義。影響人類健康的五大因素：個(gè)人因素占60%;遺傳因素占15%;社會(huì)因素占10%;醫(yī)療條件僅占8%;氣候環(huán)境占7%。本組數(shù)據(jù)就充分說(shuō)明了這類問(wèn)題。冠心病是一種多因子疾病，是遺傳因素和環(huán)境因素等共同作用的結(jié)果。在人類基因組中，有2萬(wàn)多個(gè)基因在心血管系統(tǒng)表達(dá)。許多已知的候選基因變異并沒(méi)有證明能明顯增加冠心病的危險(xiǎn)性，但是當(dāng)數(shù)個(gè)等位基因變異同時(shí)出現(xiàn)在某一個(gè)體時(shí)，就有可能導(dǎo)致該個(gè)體患冠心病的危險(xiǎn)性增加。這些多態(tài)性基因的不同表達(dá)方式，常常需要環(huán)境因素的作用，與此同時(shí)，人類基因組的許多基因也影響環(huán)境因素對(duì)機(jī)體的作用。對(duì)于已有初步癥狀的患病人群，基因檢測(cè)可以幫助臨床進(jìn)行確診，并可針對(duì)易感風(fēng)險(xiǎn)基因的攜帶情況，彌補(bǔ)易感基因造成的功能缺陷，進(jìn)行相應(yīng)治療。

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8 Lindgren P，Lindstrom J，Tuomilehto J et al．DPS Study Group.Lifestyle intervention to prevent diabetes in men and women with impaired glucose tolerance is cost-effective［J］.Int J Technol Assess Health Care，2007;23(2)：177-183.