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        丹參注射液對兔視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷后視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞凋亡和caspase-3表達(dá)的影響

        2012-01-23 11:54:16張鐵華張永利張春麗劉林英楊濤
        中國中醫(yī)急癥 2012年11期
        關(guān)鍵詞:神經(jīng)節(jié)陽性細(xì)胞丹參

        張鐵華張永利張春麗劉林英楊濤

        (1.河北省玉田縣醫(yī)院,河北玉田064100;2.河北省唐山市協(xié)和醫(yī)院,河北唐山063000)

        視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷是多因素綜合作用的結(jié)果 ,主要包括氧自由基的損傷作用,細(xì)胞內(nèi)的鈣超載現(xiàn)象,白細(xì)胞作用以及細(xì)胞凋亡等。動物實(shí)驗(yàn)表明,丹參對視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷有保護(hù)作用,本實(shí)驗(yàn)通過建立兔視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷模型,觀察應(yīng)用丹參注射液后,對兔視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡及半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)表達(dá)的影響,進(jìn)一步證實(shí)丹參注射液對視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)動物48只健康純種大耳白兔,購于北京實(shí)驗(yàn)動物中心,體質(zhì)量(3.0±0.2)kg,雄性,外眼及眼底檢查均正常,室溫環(huán)境飼養(yǎng)。

        1.2 試藥與儀器OLYMPUS光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)Hplas-1000彩色病理圖文分析系統(tǒng)(同濟(jì)千屏影像工程公司)丹參注射液(四川三精升和制藥有限公司10 mL/支),細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司),SABC試劑盒(即用型,武漢博士德生物工程有限公司),Caspase-3免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

        1.3 分組與給藥隨機(jī)分為對照組與治療組,以20%烏拉坦5 mL/kg耳緣靜脈注射麻醉,同時(shí)兔眼滴用0.4%倍諾喜(奧布卡因)行表面麻醉,對照組球后注射平衡鹽溶液0.05 mL(48只,左眼),治療組球后注射丹參注射液0.05 mL(48只,右眼)。

        1.4 模型制備給藥30min后開始建立模型,復(fù)方托品酰胺滴眼液散瞳后將連接生理鹽水的5號頭皮針從耳前方角鞏膜緣內(nèi)刺入前房,緩慢升高輸液瓶高度產(chǎn)生16.7kPa壓力,觀察并監(jiān)測眼睛情況。60min后將輸液瓶高度逐漸降低,緩慢減低眼內(nèi)壓,直至輸液瓶高度到動物眼球水平,拔除灌注針頭,視網(wǎng)膜血供恢復(fù)。

        1.5 標(biāo)本采集與檢測根據(jù)各組不同的再灌注時(shí)間,分別于損傷后1、6、24和72 h全身麻醉后,耳緣靜脈快速注入空氣栓塞處死,取出眼球,至于冰生理鹽水中,剪開角鞏膜緣,棄去眼前節(jié)及玻璃體,外翻眼球壁,在顯微鏡下剝離視網(wǎng)膜,分析天平稱重,用生理鹽水稀釋,勻漿,低溫離心機(jī)3500 r/min離心10 min,取上清液,置于4%多聚甲醛固定24 h,然后小心去除角膜、虹膜、晶狀體及玻璃體,將后段眼環(huán)再固定4 h。流動自來水沖洗24 h,之后于75%酒精(60 min)→85%酒精(60 min)→95%酒精(60 min)→95%酒精(60 min)→無水酒精Ⅰ(60 min)→無水酒精Ⅱ(40 min)→二甲苯Ⅰ(15 min)→二甲苯Ⅱ(10 min)→將眼球壁自視乳頭處縱向切開,距角鞏膜緣0.2 mm向鼻側(cè)和顳側(cè)各取1 cm×0.5 cm的視網(wǎng)膜組織,將視網(wǎng)膜組織分別置于68℃恒溫箱浸蠟(2 h),石蠟包埋。行前后方向視網(wǎng)膜全層切片,片厚2.5 μm。切片分采用TUNEL(即脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法)染色計(jì)數(shù)凋亡陽性細(xì)胞及計(jì)數(shù)Caspase-3的蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞。

        1.5.1 視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞凋亡的檢測每只眼球取兩張切片進(jìn)行分析,用圖像分析計(jì)數(shù)系統(tǒng)對凋亡神經(jīng)節(jié)細(xì)胞切片進(jìn)行圖像分析。在圖像分析儀上對待測樣本取樣,在視網(wǎng)膜切片中央部位向兩側(cè)各取兩個(gè)連續(xù)不重疊的高倍視野(HP),分別計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù),4者相加的結(jié)果 作為每mm2的平均TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)。

        1.5.2 免疫組化檢測Caspase-3蛋白表達(dá)按試劑盒說明進(jìn)行操作,細(xì)胞漿染成棕黃色為蛋白陽性表達(dá)。在視網(wǎng)膜切片中央部位向兩側(cè)各取兩個(gè)連續(xù)不重疊的高倍視野(HP),計(jì)數(shù)每個(gè)視野陽性細(xì)胞數(shù),算出平均數(shù)即為每張切片陽性細(xì)胞數(shù)。

        1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。數(shù)據(jù)以(±s)表示,兩組樣本均數(shù)差別的t檢驗(yàn),方差分析同一組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)數(shù)據(jù)的差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 丹參注射液對視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞凋亡的影響見表1。除1 h外,同一時(shí)間點(diǎn)對照組與治療組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

        2.2 丹參注射液Caspase-3的蛋白表達(dá)的影響見表2。除1h外,同一時(shí)間點(diǎn)對照組與治療組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

        3 討論

        視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷是眼科臨床常見的一種病理過程,如視網(wǎng)膜中央動脈栓塞、缺血性視神經(jīng)病變、青光眼等在這個(gè)過程中,細(xì)胞凋亡發(fā)揮著重要的作用。有研究表明,RIR是通過誘發(fā)細(xì)胞凋亡引起神經(jīng)元死亡所致,最終的結(jié)局均是RGC的凋亡[1]。

        近年來發(fā)現(xiàn),凋亡是RIRI后神經(jīng)節(jié)細(xì)胞死亡的形式之一[2]。凌士奇等[3]通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)RIR中視網(wǎng)膜內(nèi)層細(xì)胞存在著明顯的凋亡征象,尤以RIRI 24 h組最為顯著。凋亡細(xì)胞的出現(xiàn)遵循其規(guī)律,張瑞等[4]通過對大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷模型中缺血再灌注視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu)觀察,發(fā)現(xiàn)再灌注24 h視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量明顯減少,可見凋亡小體。李國棟等[5]應(yīng)用TUNEL的方法 ,研究發(fā)現(xiàn),正常大鼠視網(wǎng)膜TUNEL染色陰性。Kaneda[6]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)凋亡最早出現(xiàn)在視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷后6 h,24 h凋亡細(xì)胞的數(shù)量達(dá)到高峰,48 h開始下降,168 h凋亡細(xì)胞數(shù)目已經(jīng)極少,而在正常視網(wǎng)膜幾乎未見神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡。筆者應(yīng)用TUNEL方法 進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測,研究發(fā)現(xiàn):正常兔視網(wǎng)膜TUNEL染色陰性,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果 也證實(shí)了上述觀點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果 為:在缺血再灌注損傷過程中發(fā)生了細(xì)胞凋亡,凋亡細(xì)胞主要分布在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層,最早出現(xiàn)在再灌注后1 h,6 h后視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡數(shù)量增加,24 h細(xì)胞凋亡數(shù)量達(dá)到了高峰,并在外核層偶爾可見凋亡細(xì)胞,到了再灌注后72 h,仍然有凋亡細(xì)胞,說明了再灌注后72 h,視網(wǎng)膜的損傷尚未完全修復(fù),與Ettaiche等[7]的研究結(jié)果 相近。

        天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白激酶家族(caspases)是細(xì)胞凋亡過程中最重要的蛋白酶,凋亡的最后實(shí)施是通過caspases的激活而實(shí)現(xiàn)的。Caspases的激活表現(xiàn)為“瀑布式”的級聯(lián)反應(yīng),而caspase-3是caspases級聯(lián)反應(yīng)中下行的最關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行蛋白酶,在各種程序啟動的凋亡程序中起最后樞紐的作用[8]。caspase-3作為細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵性蛋白酶,直接導(dǎo)致凋亡細(xì)胞解體,酶解細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白,切斷凋亡細(xì)胞與周圍細(xì)胞的聯(lián)系,關(guān)閉DNA的復(fù)制與修復(fù),降解DNA,最后將細(xì)胞解體并包裹形成凋亡小體[9]。caspase-3(cpp32)處于被認(rèn)為是蛋白級聯(lián)切割過程的凋亡核心位置,起著很重要的作用,稱為死亡蛋白酶[10]。本研究發(fā)現(xiàn)caspase-3在視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷中表達(dá)明顯增多,進(jìn)一步證實(shí)此過程中細(xì)胞凋亡的存在,而治療組中,caspase-3表達(dá)明顯減弱。由上可以看出,丹參注射液能夠抑制caspase-3表達(dá),并進(jìn)而抑制不同因素誘導(dǎo)的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡,從本實(shí)驗(yàn)中可以得出,丹參注射液在視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷中通過抑制caspase-3的表達(dá)而達(dá)到抑制凋亡的目的 。

        本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用球后注射丹參注射液治療兔視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷,觀察其對視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞凋亡、caspase-3蛋白表達(dá)的影響,結(jié)果 顯示:除1h外,治療組各時(shí)間點(diǎn)凋亡細(xì)胞數(shù)量、caspase-3蛋白表達(dá)均較對照組明顯減少。從本實(shí)驗(yàn)中可以得出:丹參注射液可以通過抑制細(xì)胞凋亡、抑制caspase-3表達(dá)和活化而起到對視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的保護(hù)與治療作用。

        表1 兩組凋亡陽性細(xì)胞數(shù)比較(個(gè)/mm2,±s)

        表1 兩組凋亡陽性細(xì)胞數(shù)比較(個(gè)/mm2,±s)

        與對照組同一時(shí)間比較,*P<0.05。下同

        組別再灌注24 h再灌注72 h治療組11.55±0.24*5.39±0.26*對照組18.56±0.277.00±0.21再灌注1 h再灌注6 h 1.10±0.116.58±0.27*1.16±0.1310.31±0.22 n 12 12

        表2 兩組視網(wǎng)膜缺血再灌注后不同時(shí)段Caspase-3表達(dá)比較(細(xì)胞數(shù)/mm2,±s)

        表2 兩組視網(wǎng)膜缺血再灌注后不同時(shí)段Caspase-3表達(dá)比較(細(xì)胞數(shù)/mm2,±s)

        組別再灌注24 h再灌注72 h治療組8.25±0.15*5.23±0.26*對照組14.19±0.216.72±0.23 n 12 12再灌注1 h再灌注6 h 1.12±0.135.52±0.14*1.15±0.158.32±0.16

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