盧 欣

鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 鄭州 450052

由于缺血再灌注或炎癥引起的氧自由基損傷是導(dǎo)致眾多疾病的原因之一。氫氣作為抗氧化劑可以選擇性地減少細(xì)胞內(nèi)氧自由基，從而起到預(yù)防和治療疾病的作用。氫氣可以選擇性減少羥自由基，特別是活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS），從而保護(hù)細(xì)胞。但氫氣并不直接與ROS反應(yīng)，通入氫氣可以減輕和抑制氧應(yīng)激造成的損傷程度。由于氫氣可以快速通過(guò)細(xì)胞膜，因此可作為高效的抗氧化劑，減少細(xì)胞內(nèi)ROS的生成來(lái)減少氧損傷從而保護(hù)細(xì)胞［1］。本實(shí)驗(yàn)用MTT法檢測(cè)氫氣預(yù)處理后的海馬神經(jīng)元細(xì)胞活力，觀察氫氣對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級(jí)新生SD乳鼠（＜24h），由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，DMEM高糖培養(yǎng)基（美國(guó)Sigma公司），特級(jí)胎牛血清（美國(guó)Sigma公司），胰蛋白酶粉（美國(guó)Sigma公司），NSE染色試劑盒（美國(guó)Sigma公司），MTT試劑（美國(guó)Sigma公司）。

1.2 方法

1.2.1 體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元細(xì)胞：實(shí)驗(yàn)步驟：用75%酒精消毒新生SD乳鼠（＜24h）8只，在超凈工作臺(tái)內(nèi)斷頭取出顱腦，放入預(yù)冷的PBS緩沖液中，剝離兩側(cè)海馬，在體視顯微鏡下剔除被膜和血管，剪成0.5mm3大小的組織塊，加入0.25%胰蛋白酶10mL，37℃水浴消化15min，每間隔5min吹打混勻1次。加入等體積含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液終止消化3min，加入3倍體積培養(yǎng)基吹打混勻，用2 000目尼龍網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞懸液。調(diào)整細(xì)胞密度，按2×105／mL接種于6孔培養(yǎng)板和9×104／mL接種于96孔培養(yǎng)板中，置入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日換液，取第5天細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組：隨機(jī)分為3組，對(duì)照組：常規(guī)培養(yǎng)；缺氧／復(fù)氧組（H／R組）：細(xì)胞在100%N2中培養(yǎng)15min后放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min，造成缺氧／復(fù)氧損傷；氫氣預(yù)處理組：細(xì)胞在2%H2＋98%N2中培養(yǎng)15min后放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min。

1.2.3 神經(jīng)元鑒定：將處理后6孔板中細(xì)胞用1：1的甲醇：丙酮固定30min，用預(yù)冷的PBS沖洗3遍后，按照進(jìn)行NSE試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行免疫化學(xué)染色，著色陽(yáng)性為棕黃色。

1.2.4 細(xì)胞活力測(cè)定：將處理后96孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔加入MTT（5g／L）20μL和180μL無(wú)血清培養(yǎng)液，孵育4h后終止培養(yǎng)。盡可能吸凈每孔MTT液后，加入100μL二甲基亞砜（DMSO），震蕩10min，在酶聯(lián)儀595nm處測(cè)定吸光值（OD）。細(xì)胞活力（%）＝（實(shí)驗(yàn)組OD／對(duì)照組OD）×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

免疫化學(xué)染色顯示：對(duì)照組視野布滿棕黃色陽(yáng)性細(xì)胞，細(xì)胞胞體不規(guī)則，神經(jīng)突觸互相連接成網(wǎng)；缺氧／復(fù)氧組棕黃色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較少，細(xì)胞皺縮，神經(jīng)突觸很少，氫氣預(yù)處理組棕黃色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比缺氧／復(fù)氧組多，仍能看到不規(guī)則的胞體形態(tài)，仍有連接的神經(jīng)突觸。

細(xì)胞活力測(cè)定顯示：以對(duì)照組海馬神經(jīng)元的細(xì)胞活力100%，缺氧／復(fù)氧組（39.8±2.41）%，氫氣預(yù)處理組（51.0± 1.94）%。與對(duì)照組比較，缺氧／復(fù)氧損傷使細(xì)胞活力大為降低（P＜0.05），而氫氣預(yù)處理組的細(xì)胞活力較缺氧／復(fù)氧組明顯升高（P＜0.05），說(shuō)明氫氣能夠提高海馬神經(jīng)元細(xì)胞的活力，減少缺氧／復(fù)氧損傷。

3 討論

氫氣是一種雙原子氣體，密度小于空氣，在一些化學(xué)反應(yīng)中有一定的還原性，被認(rèn)為是惰性氣體。Downey等［2］的研究表明，氫氣（hydrogen，H2）可能是除了一氧化碳（carbon monoxide，CO）、硫化氫（hydrogen sulfide，H2S）和一氧化氮（nitric oxide，NO）的第四類氣體類的信號(hào)分子（gasotransmitter），在某些情況下可以參與機(jī)體的抗氧化過(guò)程［3］。Maier等［4－6］的研究表明，大鼠吸入2%氫氣可顯著減輕腦缺氧／復(fù)氧損傷，說(shuō)明氫氣是一種比較理想的細(xì)胞保護(hù)劑。這是由于氫氣是一種較小的生物活性分子，透過(guò)細(xì)胞膜的速度較快，又易于進(jìn)入線粒體。雖然氫氣不直接和氧自由基反應(yīng)，但可作為高效的抗氧化劑，選擇性地減少ROS［7］。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元細(xì)胞，制造缺氧／復(fù)氧損傷模型，采用免疫化學(xué)鑒定和MTT法初步探討了氫氣對(duì)海馬神經(jīng)元細(xì)胞缺氧／復(fù)氧損傷的保護(hù)作用。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明氫氣預(yù)處理可增加細(xì)胞活力，從而對(duì)離體的海馬神經(jīng)元細(xì)胞缺氧／復(fù)氧損傷起到保護(hù)作用。

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［2］ 胡文忠，王曉強(qiáng).一氧化氮與一氧化氮合酶抑制劑對(duì)腦缺血后海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用［J］.中國(guó)實(shí)用神經(jīng)疾病雜志，2011，14（3）：8－9.

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