楊 靜，劉洪斌，李東華

天津市中西醫(yī)結(jié)合急腹癥研究所（天津 300100）

膿毒癥是指由感染或高度可疑感染灶引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)，其病原體包括細(xì)菌、真菌、寄生蟲及病毒等。膿毒癥病情兇險(xiǎn)，病死率高。近年來(lái)，抗感染治療和器官功能支持技術(shù)取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，但病死率仍高達(dá)30%～70%[1]。本文所研究的清熱解毒方由大黃、黃芩、白頭翁、敗醬草等組成，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的臨床和科研應(yīng)用，具有良好的療效[2]。本研究重點(diǎn)探討該方對(duì)膿毒癥大鼠多器官衰竭的改善作用，進(jìn)一步探討其治療機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 健康Wistar大鼠88只（由天津市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物飼養(yǎng)合格證為（07311），雌雄各半，體質(zhì)量（250±30）g。標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng)。隨機(jī)分為7組：正常對(duì)照組（20只）、模型組（20 只）、QR1 組（9 只）、QR2 組（9 只）、血必凈組(10只)。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器 流式細(xì)胞儀（BD Calibur, 美國(guó)），電子天平（SARTORINS,德國(guó)）。

1.3 相關(guān)試劑 熒光抗體：P-selectin Mouse anti-Human Monoclonal Antibody-LS-C44841，Integrin，Beta 3 Hamster anti-Mouse Monoclonal Antibody-LS-C44643均購(gòu)自LIFESPAN BIOSCIENCES。

1.4 受試藥物 清熱解毒方1（QR1）、清熱解毒方2（QR2）由華西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院提供，批號(hào)：201008。該方由大黃、黃芩、白頭翁、敗醬草等按不同比例配伍而成，定容至相當(dāng)于3 μg·mL-1生藥（配比見(jiàn)表1）。血必凈注射劑由紅花、赤芍、川芎、丹參、當(dāng)歸等中藥材提取物組成，主要成分為紅花黃色素A等。

1.5 模型制備與給藥方法 實(shí)驗(yàn)前12 h禁食、不禁水，10%水合氯醛腹腔注射麻醉。開腹，分離盲腸，在距其末端2 cm處以1號(hào)絲線結(jié)扎, 再用18號(hào)針頭在盲腸末端穿孔, 將盲腸放回腹腔后逐層關(guān)腹。連續(xù)觀察72 h。各給藥組于術(shù)前1 d 給藥，連續(xù)給藥3 d，1次/d灌胃，劑量為24 μg·kg-1生藥。對(duì)照組及模型組為等量生理鹽水灌胃。

表1 清熱解毒方不同成分配比表

1.6 檢測(cè)指標(biāo) 治療72 h，各組動(dòng)物經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，部分用EDTA 抗凝，離心分離血清-30 ℃凍存；其余血液肝素鈉抗凝。樣品制備方法：每管加入熒光抗體各10 μL，抗凝血5 μL，混勻，室溫避光孵育15 min，加入PBS 稀釋的1%多聚甲醛1 mL，4 ℃靜置30 min后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±sd）表示，數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行方差分析，采用LSD 法行兩兩比較，P ＜0.05 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 0～72 h 各組大鼠死亡率 正常對(duì)照組大鼠無(wú)一死亡；模型組，造模3 d 后死亡率為65%，QR1 組死亡率為11.1%，QR2 組死亡率為55.60%，血必凈對(duì)照組死亡率為50%。詳見(jiàn)表2。由此可見(jiàn)，就提高模型大鼠的存活率而言，QR1 有較好的療效。QR2組為敗醬草缺如組，此結(jié)果提示敗醬草在清熱解毒方改善大鼠存活率方面發(fā)揮了重要作用。

2.2 血小板表面蛋白CD62P 的表達(dá) 與正常組相比，膿毒癥模型組血小板表面顆粒CD62P的表達(dá)陽(yáng)性率有明顯的升高，而QR1 在給藥的3 d 后可以降低CD62P 陽(yáng)性血小板的百分率，此效果優(yōu)于QR2組。詳見(jiàn)表3。

表2 治療后0～72 h各組大鼠死亡率比較

表3 治療72 h后大鼠血小板CD62P的變化(x±sd）

2.3 腎功能變化 模型組動(dòng)物在造模后血清中的BUN、Cr 水平較之正常對(duì)照組顯著增高(P ＜0.05)；各治療組與模型組相比BUN、Cr的表達(dá)水平均有不同程度的降低，治療組間差異不顯著。詳見(jiàn)表4。

表4 治療3 d后大鼠血中BUN/Cr的變化(x±sd）

2.4 肝功能變化 造模后，模型組動(dòng)物血清中反映肝功能的指標(biāo)AST、ALT 水平以及AST/ALT 比值較正常對(duì)照組均有顯著增高(P ＜0.01)；給藥以后，各組檢測(cè)指標(biāo)都有不同程度的降低：QR1、QR2、血必凈組可以明顯降低AST水平（P＜0.05)，組間比較血必凈組效果最好，QR1 組與QR2 組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；QR1組與血必凈組可以降低ALT 表達(dá)水平，血必凈效果較好；給清熱解毒方治療后，各配伍組AST/ALT比值均有所降低，血必凈組無(wú)此作用。詳見(jiàn)表5。

表5 治療3 d后大鼠血中ALT、AST的變化(x±sd，U/L）

3 討論

膿毒癥是由于機(jī)體對(duì)微生物感染、創(chuàng)傷或燒傷等反應(yīng)引起的一種嚴(yán)重綜合征，常伴隨SIRS和多器官功能障礙。盡管近年來(lái)在膿毒癥的基礎(chǔ)研究和臨床治療上都取得了可喜的進(jìn)步，但其死亡率仍居高不下。隨著病情的進(jìn)展，膿毒癥所導(dǎo)致的各器官可逆性的功能障礙（表現(xiàn)為線粒體攝氧和氧化功能障礙，引起ATP 的合成障礙和快速耗竭）轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢赡嫘云鞴偎ソ呤遣∪酥滤赖闹饕騕1]。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，膿毒癥的主要病因、病機(jī)可概括為邪毒入侵(嚴(yán)重感染、中毒、休克等)或各種創(chuàng)傷(外傷、燒傷、燙傷、手術(shù)等)導(dǎo)致正邪交爭(zhēng)、正氣耗傷、邪毒阻滯、正虛邪實(shí)。進(jìn)一步分為毒熱證，瘀血證，急性虛證等。目前中醫(yī)藥治療膿毒癥側(cè)重于清熱解毒、通腹瀉下、活血化瘀等方面[2]。本研究所采用的清熱解毒方由金匱瀉心湯加減衍化而來(lái)，由大黃、黃芩、白頭翁、敗醬草組成，兼有通里攻下和清熱解毒雙重功效。血必凈注射液由紅花、赤芍、川芎、丹參、當(dāng)歸等中藥材提取物組成，主治全身炎性反應(yīng)綜合征、多器官功能失調(diào)綜合征。

大鼠CLP模型是目前公認(rèn)的臨床相關(guān)性較強(qiáng)的膿毒癥模型。本研究通過(guò)此模型的建立，旨在觀察清熱解毒方對(duì)膿毒癥大鼠受損臟器如肝、腎以及血液系統(tǒng)的治療效果，探討其作用機(jī)制，為臨床更加合理應(yīng)用、研發(fā)新藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

首先我們著眼于動(dòng)物的整體生存狀態(tài)，研究發(fā)現(xiàn)，CLP 模型大鼠在0～24 h 的死亡率為35%，24～48 h 內(nèi)死亡率為46%，48～72 h 內(nèi)無(wú)死亡。給予QR1 治療后72 h 死亡率為11.1%。與之相反，QR2組以及血必凈組死亡率均較高。值得注意的是，各組大鼠的死亡時(shí)間主要集中于48 h之內(nèi)，這說(shuō)明膿毒癥早期所導(dǎo)致的急性炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致死亡的重要原因。隨著時(shí)間的發(fā)展以及有效的臨床干預(yù)，一般認(rèn)為，膿毒癥后期免疫抑制而導(dǎo)致的感染與病程后期病人的死亡密切相關(guān)[3]。QR2 組為敗醬草缺如組，可見(jiàn)，本實(shí)驗(yàn)中敗醬草在清熱解毒方改善大鼠存活率方面發(fā)揮了主要的作用。敗醬為敗醬科植物黃花敗醬、白花敗醬的干燥全草；性微寒，味辛、苦；入胃、大腸、肝經(jīng)；具有清熱解毒、消癰排膿、祛瘀止痛之功效。敗醬草具有很高的藥用價(jià)值，主要表現(xiàn)在抗炎方面，如治療慢性盆腔炎、結(jié)腸炎、前列腺炎等。推測(cè)其改善生存率的機(jī)制很可能與其具有較強(qiáng)的抗炎作用密切相關(guān)。

眾所周知，活化血小板是血栓的主要成分，也是引起血栓的主要原因。研究發(fā)現(xiàn)：膿毒性休克的患者血液流變學(xué)和血小板功能均發(fā)生異常，隨著病情加重血小板功能障礙加劇，血小板功能障礙在MODS發(fā)病機(jī)制中起更加重要的作用[4-6]。本研究發(fā)現(xiàn)：清熱解毒方QR1組能夠降低血小板CD62P的表達(dá)，QR2 組（敗醬草缺如組）效果較差，這一變化與大鼠的存活率相對(duì)應(yīng)。推斷膿毒癥時(shí)病原和活化的炎性介質(zhì)激活了凝血系統(tǒng)，直至出現(xiàn)彌散性血管內(nèi)凝血與死亡率有著密切的聯(lián)系，而血液系統(tǒng)的改善與否直接關(guān)系了治療的成敗。

國(guó)內(nèi)外研究證實(shí)，膿毒癥是急性腎損傷的重要的危險(xiǎn)因素，同時(shí)膿毒癥并發(fā)急性腎衰將有25．3%的死亡率[7]。更有學(xué)者認(rèn)為，膿毒癥大鼠早期就存在有腎功能損害[8]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，清熱解毒不同配伍組都可以有效的改善膿毒癥大鼠受損的腎臟機(jī)能。

肝臟作為人體的重要組織器官，參與機(jī)體的代謝、解毒、排泄、凝血等多種生理功能。血清天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）和血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)是慢性肝病診斷中重要和敏感的檢測(cè)指標(biāo)。研究表明，觀察兩者的變化和比值，對(duì)了解肝病的嚴(yán)重程度和判斷預(yù)后有一定價(jià)值[9-11]。本研究中，膿毒癥模型大鼠的AST 和ALT 的值顯著升高，給藥后各清熱解毒方組都顯著降低了AST/ALT 比值；其中血必凈組和QR1(大黃:黃芩:白頭翁:敗醬草=4:4:6:6)組對(duì)損傷的肝細(xì)胞有廣泛的修復(fù)作用，表現(xiàn)為AST水平和ALT 水平顯著下降；而QR2 組只降低了AST的表達(dá)水平，即改善線粒體的功能；本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了敗醬草在清熱解毒方中的保肝作用。

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