湯曉東 劉雙海

·綜述與講座·

胰腺癌基因治療進展

湯曉東 劉雙海

胰腺癌多發(fā)生于中老年人，發(fā)達國家發(fā)病率高于發(fā)展中國家。隨著我國生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，近年來胰腺癌的發(fā)病率呈現(xiàn)上升的趨勢，并且有年輕化的傾向。目前對于胰腺癌的治療方法主要包括手術切除、放化療、基因治療、內(nèi)分泌治療、中醫(yī)治療等，但仍沒有徹底治愈的方案，各國學者仍在致力于研究更有效的治療方法。近年來，分子靶向治療成為腫瘤治療領域的新熱點，本文就胰腺癌的基因治療方面取得的最新研究成果做一綜述。

一、反義基因治療

反義基因治療技術的原理是反義寡核苷酸以互補的形式與特定的DNA或RNA序列結(jié)合，從而阻止DNA的轉(zhuǎn)錄或RNA的翻譯，使腫瘤基因無法表達。在胰腺癌中，最常見K-ras基因突變，因此，K-ras基因常作為胰腺癌基因治療的靶點。此外，通過反義核酸技術使突變基因ATK2、cerbB2激活抑癌基因表達，從而達到治療目的。Morioka等[1]應用靶向K-ras的反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染胰腺癌細胞HaP-T1可抑制其增殖，且能使基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)和基質(zhì)金屬蛋白-9(MMP-9) 的活化下調(diào)；在動物體內(nèi)種植瘤實驗中，應用反義寡核苷酸治療的動物生存期顯著長于對照組，且發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的時間更晚。我國學者韓旭等[2]應用電轉(zhuǎn)染方法分別用整合素αV、β3及αVβ3反義基因治療胰腺癌大鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組、αV組、β3組及αVβ3組腫瘤質(zhì)量分別為 (1.17±0.79)、(0.95±0.26)、(1.013±0.42)和(0.79±0.56)g；微血管密度分別為18.33±1.39、13.80±1.06、15.96±1.24和12.16±1.23；腫瘤細胞凋亡指數(shù)分別為12.30±1.393、22.17±1.23、20.37±1.07和24.10±0.99，各組間差異均具有統(tǒng)計學意義。作者認為，應用整合素αV、β3和αVβ3反義基因治療可通過抑制癌組織血管生長，促進癌細胞凋亡，從而抑制腫瘤的生長。

二、自殺基因治療

自殺基因治療也稱作前體藥物敏感基因療法(prodrugsensitive genes therapy)，是利用轉(zhuǎn)基因的方法將哺乳動物本身不含有的藥物酶基因轉(zhuǎn)入腫瘤細胞內(nèi)。該基因表達的產(chǎn)物可以將無毒的藥物前體轉(zhuǎn)化為有毒性的藥物，從而干擾腫瘤細胞DNA的合成，殺死腫瘤細胞[3]。Eisold等、Fogar等[4-5]研究報道，胞嘧啶脫氨酶(cystodine deaminase，CD)能夠催化5-氟胞嘧啶(5-FC)轉(zhuǎn)化為5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil, 5-FU)，因5-FU具有強烈的細胞毒作用，能夠抑制DNA和RNA的合成，從而導致細胞死亡，因此CD基因是一種自殺基因。Li等[6]將攜帶CD基因的腺病毒pAd Track-CMV-CD感染細菌，與pAdEasy-1整合，后再感染人胰腺癌細胞系Patu8988和SW1990，然后在這兩種細胞系的培養(yǎng)液中中加入5-Fc，所獲得的陽性克隆中病毒脂質(zhì)內(nèi)的CD基因濃度高達2×1011pfu/ml。張世能等[7]用同源重組技術構(gòu)建了腺病毒Ad-CD、Ad-GFP和Ad-CD/UPRT，體外感染人胰腺癌細胞SW1990，同時，建立胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型，在瘤體內(nèi)注射腺病毒進行治療。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染CD/UPRT的胰腺癌SW1990細胞對5-FC的敏感性明顯提高,Ad-CD/UPRT組的半數(shù)抑制劑量(IC50)為25 μmol/L,而Ad-CD組和Ad-GFP組分別為100 μmol/L和>1000 μmol/L。Ad-CD組、Ad-CD/UPRT組和Ad-GFP組的細胞凋亡率分別為61.3%、40.5%和3.0%,3組間差異有統(tǒng)計學意義。Ad-CD/UPRT瘤內(nèi)注射治療后，移植瘤體積縮小81%,Ad-GFP治療腫瘤致使其縮小63%。作者認為CD/UPRT自殺基因系統(tǒng)能夠顯著地加速胰腺癌細胞的凋亡。Tang等[8]對胃癌的研究和Kajiwara等[9]對鼻咽癌的研究證實，單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶(herpessimplex virus thymidine kinase，HSV-tk)基因可催化抗病毒藥物丙氧鳥苷(GCV)產(chǎn)生磷酸化反應，通過阻止DNA復制過程發(fā)揮細胞毒效應。Luo等、Duarte等[10-11]報道指出，目前HSV-TK基因療法最常用的藥物主要是嘌呤核苷類似物，包括阿昔洛韋(ACV)及其衍生物GCV、潘洛昔非(PCV)和布洛昔非(BCV)，其中GCV最常用。

三、免疫基因治療

免疫基因治療就是將各種細胞因子基因?qū)肽[瘤或其他免疫效應細胞，使其在機體表達分泌細胞因子或利用其他基因分子增強腫瘤細胞的免疫原性或免疫系統(tǒng)功能，或應用IL-4基因修飾的胰腺癌疫苗等使機體產(chǎn)生特異性抗體進行免疫基因治療，以加速腫瘤的消退。Liu等[12]研究表明，gammadelta-T細胞具有先天的抗腫瘤特性， 能夠識別并殺死腫瘤細胞， 特別是對上皮細胞起源的惡性腫瘤更為敏感，因此可將其用于治療上皮細胞起源的胰腺癌。此外，Yang等[13]在小鼠模型中應用轉(zhuǎn)染突變K-ras基因且表面有效表達抗原表位(K-ras-12-Val) 的樹突狀細胞(dentritic cell， DC)，結(jié)果表明治療組小鼠有更高的存活率和更長的存活時間，且移植瘤的體積更明顯縮小[(68±13)mm3比(87±14)mm3和(79±19)mm3，P<0.05]，成為腫瘤免疫基因治療的新熱點。Xu等[14]構(gòu)建了一種CEA啟動子調(diào)控的溶瘤腺病毒載體用于動物實驗。在人胰腺癌PANC1免疫缺陷的裸鼠移植瘤模型中，CEA啟動子調(diào)控的腺病毒AdCEAp-HSP70能夠顯著抑制腫瘤的生長；在大鼠胰腺癌DSL-6A/C1模型中，CD4+、CD8+和gamma/delta T細胞浸潤腫瘤細胞，誘導宿主分泌細胞因子TGF-β、INF-γ和IL-6，產(chǎn)生雙抗腫瘤作用，完全抑制胰腺癌的生長。作者認為，CEA啟動子控制下的溶瘤腺病毒對癌癥的基因治療具有較高的安全性和療效，具有廣闊的應用和發(fā)展前景。

四、抗血管形成基因治療

這種療法依賴于激活抑制血管生長因子(VEGF)或TNF、p53、PEDF等抑制因子，抑制腫瘤的血管形成和生長，從而抑制腫瘤細胞的生長和存活。Zhu等[15]采用實時PCR檢測60例配對胰腺癌組織的HIF-1α、EPAS1和VEGF mRNAs的表達；采用蛋白質(zhì)印跡法和免疫組化法、過氧化物酶法檢測HIF-1α、EPAS1和VEGF蛋白的表達，同時評估微血管密度(MVD)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)胰腺癌組織的EPAS1、VEGF基因表達顯著升高，MVD顯著增加，EPAS1與VEGF、VEGF與MVD、EPAS1與MAD之間均具有顯著的相關性，EPAS1、VEGF的表達與MVD及TNM分期、腫瘤大小顯著相關。Elbarbary等[16]研究認為，可溶性重組血管內(nèi)皮生長因子受體VEGF-Trap可與VEGF緊密結(jié)合，顯著抑制VEGF的功能，從而使胰腺癌細胞處于缺血狀態(tài)。Pittella等[17]制備了具有生物相容性的CAP/siRNA混合納米材料，將攜帶VEGF的siRNA納米粒子材料治療裸鼠皮下BxPC3種植瘤，可抑制種植瘤的生長，并與腫瘤中的siRNA蓄積增強和顯著的VEGF基因沉默具有良好的一致性。

五、腫瘤裂解病毒基因治療

這種療法基于經(jīng)改造過的野生型病毒能裂解腫瘤細胞而不會損害正常細胞的機制。Bouvet等[18]應用含野生型p53抑癌基因構(gòu)建的Ad5/CMV/β-半乳糖苷酶測定6個p53突變體胰腺癌細胞系(AsPC-1、BxPC3、Capan-1、CFPAC-1、MIA PaCa-2和PANC-1)的轉(zhuǎn)染率，結(jié)果MIA PaCa-2轉(zhuǎn)染率最高，在MOI50時，其β-半乳糖苷酶染色陽性率高達65%，而CFPAC-1細胞的β-半乳糖苷酶表達率只有15%。腺病毒介導的p53基因以劑量依賴的方式抑制人胰腺癌細胞系的生長。作者認為，通過腺病毒介導野生型p53將p53突變體引入胰腺癌中可誘導細胞凋亡和抑制細胞生長。Hwang等[19]的小鼠動物實驗研究表明，逆轉(zhuǎn)錄病毒介導的p53基因?qū)κ笤l(fā)胰腺癌或轉(zhuǎn)移性胰腺癌的生長具有顯著的抑制作用。最新的一些研究[20-22]表明，腺病毒ONYX-015是E1B(55 kDa)基因缺失的腺病毒，而E1B基因與腫瘤抑制蛋白p53結(jié)合能阻斷p53介導的轉(zhuǎn)錄活性已應用于臨床，成為胰腺癌治療的一種新策略。美國Jonaaon綜合癌癥研究中心2003年報道的I期、II期臨床試驗[23]結(jié)果顯示，腺病毒ONYX-015經(jīng)內(nèi)鏡超聲引導注射入21例胰腺癌患者的癌組織內(nèi)，每2周1次，共4次，治療后有10例患者的腫瘤體積有縮小或無進展。Caseante等[24]將HIV病毒TAT蛋白上的一個堿性結(jié)構(gòu)域中的8肽與胸苷激酶組合成Tat8-TK/GCV系統(tǒng)，并將其用于體內(nèi)試驗，結(jié)果35.6%～50%的腫瘤體積縮小。宰紅艷等[25]應用pGCSIL-PUR和pGCSIL-NEO分別構(gòu)建針對XIAP和survivin的shRNA慢病毒載體，將其感染胰腺癌細胞SW1990和PANC1，經(jīng)嘌呤霉素和新霉素篩選并擴大培養(yǎng)得到穩(wěn)定感染株。應用實時熒光定量PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測胰腺癌細胞的XIAP和survivin的表達；MTT法檢測細胞增殖和化療敏感性；測定caspase-3/7活性；DAPI 染色分析細胞凋亡。結(jié)果顯示，獲得XIAP和survivin表達穩(wěn)定的SW1990和PANC1細胞的增殖均明顯減弱，且兩種基因有協(xié)同抑制作用。雖然它們的細胞凋亡無明顯影響，但能明顯增加其對化療藥物(5-FU、吉西他濱)的敏感性。此結(jié)論為基于慢病毒載體的胰腺癌靶向基因治療提供了新的思路。

六、受體基因治療

生長抑素受體SST2能夠介導生長抑素產(chǎn)生抗增殖效應，但人胰腺癌組織中無SST2基因表達。國內(nèi)外學者[26-28]將SST2基因引入人胰腺癌組織并使其穩(wěn)定表達，從而喚起機體的自分泌反饋環(huán)，起到抑制腫瘤細胞增殖的效果。郝昆等[29]應用慢病毒介導的RNA干擾(RNAi)技術建立穩(wěn)定低表達胰島素樣生長因子1類受體(IGF1R)基因的人胰腺癌PANC1細胞株，并觀察其對吉西他濱化療敏感性的影響。結(jié)果顯示，吉西他濱對低表達IGF1R基因的PANC1細胞的IC50從(0.774±0.001)mg/L下降到(0.330±0.003)mg/L，即對吉西他濱的敏感性增加了2.35倍。在裸鼠移植瘤模型中，干擾IGF1R基因后皮下移植瘤生長緩慢，聯(lián)合應用吉西他濱后對腫瘤生長的抑制作用進一步增加。作者認為，慢病毒介導的RNA干擾技術特異性沉默IGF1R基因，能顯著增強胰腺癌細胞株PANC1對吉西他濱的敏感性。

七、特異性啟動子基因治療

該療法利用基因的靶向性傳送，將某些相關的特異性啟動子導入癌細胞，從而增加其對癌細胞的殺傷效能。劉金龍等[30]實驗證實，由Egr-1啟動子調(diào)控的TK自殺基因在γ射線作用下可以顯著提高殺傷胰腺癌細胞的能力。陳儉云等[31]將U6啟動子驅(qū)動的survivin特異性RNAi質(zhì)粒載體和陰性對照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染PANC1細胞，用RT-PCR 和蛋白質(zhì)印跡法分別檢測survivin mRNA和蛋白的表達。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染survivin特異性RNAi 載體24 h和48 h后，PANC1 細胞survivin mRNA表達抑制率分別為(52.67±3.51)% 和(75.33±3.06)%，蛋白表達抑制率分別為(58.00±3.61)% 和(76.67±4.73)%。Hendruschk等[32]的研究也得到類似的結(jié)果。由此可見，特異性啟動子基因治療或?qū)⒊蔀槟[瘤治療領域的新熱點。

[1] Morioka CY, Costa FP, Lima EMR, et al. Can antisense oligonucleotides specific to mutated Kras gene inhibit the tumor growth, invasiveness, and MMP-2 and MMP-9 expression in hamster pancreatic cancer model in vitro and in vivo? EJC suppl,2007,5:73.

[2] 韓旭,李杰,時昌文,等.整合素αV和β3反義基因抑制大鼠胰腺癌生長的實驗研究.中國現(xiàn)代普外科進展,2008,11:474-476,480.

[3] Kelber JA,Reno T,Kaushal S, et al.KRas induces a Src/PEAK1/ErbB2 kinase amplification loop that drives metastatic growth and therapy resistance in pancreatic cancer.Cancer Res,2012,72:2554-2564.

[4] Eisold S, Antolovic D, Schmidt J, et al. Effective antitumoral immune responses are not induced by cytosine deaminase suicide gene transfer in a syngeneic rat pancreatic carcinoma model. Eur Surg Res, 2006,38: 513-521.

[5] Fogar P, Navaglia F, Basso D, et al.Suicide gene therapy with the yeast fusion gene cytosine deaminase/uracil phosphoribosyltransferase is not enough for pancreatic cancer.Pancreas,2007,35:224-231.

[6] Li ZS, Pan X, Xu GM, et al. Killing effects of cytosine deaminase gene mediated by adenovirus vector on human pancreatic cancer cell lines in vitro. Hepatobiliary Pancreat Dis Int, 2003,2:147-151.

[7] 張世能,徐鳳琴,于鐘,等.腺病毒介導CD/UPRT自殺基因系統(tǒng)治療胰腺癌的實驗研究.胰腺病學,2007,7:372-374.

[8] Tang Q,Zhang D,Wan M,et al.Experimental study of the RV-HSV-TK/GCV suicide gene therapy system in gastric cancer. Cancer Biother Radiopharm,2007,22:755-761.

[9] Kajiwara E,Kawano K,Hattori Y,et al.Long-circulating liposome-encapsulated ganciclovir enhances the efficacy of HSV-TK suicide gene therapy.J Control Release,2007,120:104-110.

[10] Luo XR, Li JS, NIU Y, et al. Adenovirus-mediated double suicide gene selectively kills gastric cancer cells. Asian Pacific J Cancer Prev, 2012,13, 781-784.

[11] Duarte S, Carle G, Faneca H, et al. Suicide gene therapy in cancer: where do we stand now? Cancer Lett,2012,2:160-170.

[12] Liu Z, Guo B, Lopez RD. Expression of intercellular adhesion molecule (ICAM)-1 or ICAM-2 is critical in determining sensitivity of pancreatic cancer cells to cytolysis by human gammadelta-T cells: implications in the design of gammadelta-T-cellbased immunotherapies for pancreatic cancer. J Gastroenterol Hepatol, 2009, 24: 900-911.

[13] Yang B, He Y, Sun DL，et al．Specific immune against pancreatic cancer induced by dendritic cells pulsed with mutant K-ras peptide. Zhonghua Yixue Zazhi, 2008, 88: 1956-1960.

[14] Xu C, Sun Y, Wang Y,et al. CEA promoter-regulated oncolytic adenovirus-mediated Hsp70 expression in immune gene therapy for pancreatic cancer.Cancer Letters,2012,2:154-163.

[15] Zhu DM, Li DC, Zhang ZX, et al. Effect of endothelial PAS domain protein 1 and hypoxia inducible factor 1alpha on vascular endothelial growth factor expression in human pancreatic carcinoma.Chin Med J (Engl), 2008,121:2258-2264.

[16] Elbarbary RA, Takaku H, Tamura M, et al. Inhibition of vascular endothelial growth factor expression by TRUE gene silencing. Biochem Biophys Res Commun, 2009, 379: 924-927.

[17] Pittella F, Miyata K, Maeda Y,et al. Pancreaticcancer therapy by systemic administration of VEGF siRNA contained in calcium

phosphate/charge-conversional polymer hybrid nanoparticles. J Control Release,2012,161:868-874.

[18] Bouvet M,Bold RJ,Lee J,et al. Adenovirus-mediated wild-type p53 tumor suppressor gene therapy induces apoptosis and suppresses growth of human pancreatic cancer. Ann surg Oncol, 1998,5:681-688.

[19] Hwang RF,Gordon EM,Anderson WF,et al. Gene therapy for primary and metastatic pancreatic cancer with intraperitoneal retroviral vector bearing the wild-type p53 gene．Surgery, 1998, 124:143-150.

[20] Sinkovics JG, Horvath JC. Natural and genetically engineered viral agents for oncolysis and gene therapy of human cancers. Arch Immunol Ther Exp (Warsz), 2008, 56 Suppl 1: 3s-59s.

[21] Woo Y, Kelly KJ, Stanford MM, et al. Myxoma virus is oncolytic for human pancreatic adenocarcinoma cells. Ann Surg Oncol, 2008, 15:2329-2335.

[22] 虞昆, 趙明飛, 吳育連. 溶瘤病毒治療胰腺癌的研究進展. 國外醫(yī)學·老年醫(yī)學分冊,2006,27:185-188,192.

[23] Hecht JR, Bedford R, Abbruzzese JL, et al. A phase I/II trial of intratumoral endoscopic ultrasound injection of ONYX-015 with intravenous gemcitabine in unresectable pancreatic carcinoma. Clin Cancer Res, 2003, 9: 555-561.

[24] Cascante A, Huch M, Rodríguez LG, et al. Tat8-TK/GCV suicide gene therapy induces pancreatic tumor regression in vivo. Hum Gene Ther, 2005, 16: 1377-1388.

[25] 宰紅艷，江春，易小平，等.shRNA 穩(wěn)定抑制XIAP和survivin表達對胰腺癌細胞生物學特征的影響.中國普通外科雜志，2012，21:304-311.

[26] Carrere N, Vernejoul F, Souque A，et al．Characterization of the bystander effect of somatostatin receptor sst2 after in vivo gene transfer into human pancreatic cancer cells. Hum Gene Ther, 2005, 16: 1175-1193.

[27] Feng Y, Huang T, Gao J，et al．Inhibition of metastatic progression of SSTR2 gene transfection mediated by adenovirus in human pancreatic carcinoma cells. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci, 2006, 26: 68-71.

[28] Xu J,Amiji M.Therapeutic gene delivery and transfection in human pancreatic cancer cells using epidermal growth factor receptor-targeted gelatin nanoparticles.J Vis Exp,2012,59:e3612.

[29] 郝昆，田孝東，秦昌富，等.沉默胰島素樣生長因子1類受體基因?qū)σ认侔┘毎魉麨I化療敏感性的影響.中華實驗外科雜志，2011,7:1148-1151.

[30] 劉金龍,錢清,劉訓良,等.由Egr-1調(diào)控TK基因滅活胰腺癌細胞的實驗研究. 南京醫(yī)科大學學報(自然科學版),2007,27:1244-1247.

[31] 陳儉云，崔海寧.RNAi載體抑制survivin基因在胰腺癌PANC-1細胞中的表達.中國普通外科雜志，2012，21:317-321.

[32] Hendruschk S, Wiedemuth R, Aigner A, et al. RNA interference targeting survivin exerts antitumoral effects in vitro and in established glioma xenografts in vivo. Neuro Oncol, 2011, 13:1074-1089.

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.05.025

214400 江蘇江陰，東南大學醫(yī)學院附屬江陰醫(yī)院 肝膽外科

劉雙海，Email:liushuanghai@medmail.com.cn

2012-08-06)

(本文編輯：呂芳萍)