第二軍醫(yī)大學附屬長征醫(yī)院影像科（上海 200003）

李 斌 朱冬青 劉洪超 于 紅 劉士遠

肺部感染中的醫(yī)院獲得性肺炎（Hospital-acquired pneumonia,HAP）由于癥狀被基礎疾病或所用藥物掩蓋、病原學標本易被污染，診斷存在一定困難和延遲性，死亡率較高。綠膿桿菌是HAP特別是ICU患者肺炎的主要院內(nèi)病原菌，可能在人體潮濕部位如會陰部、腋窩、耳朵等處發(fā)生定植，并在抗生素治療中易變異而形成多重耐藥，所以在臨床存在過度治療或治療不佳的問題。因此我們采用噴霧吸入法來建立家兔綠膿桿菌肺炎模型，以期為綠膿桿菌肺炎尤其是呼吸機相關肺炎的研究提供可行的動物模型基礎。

材料與方法

1.1 實驗動物與細菌 健康新西蘭大白兔24只，兔齡6-10個月，體重2.0-2.3kg，雌雄不拘，由上海市公共衛(wèi)生臨床中心動物實驗中心提供。臨床分離的綠膿桿菌，經(jīng)VITEX微生物自動分析儀及藥敏鑒定，由上海長征醫(yī)院呼吸科實驗室提供。

1.2 試劑 普通瓊脂培養(yǎng)基；MH肉湯；0.9%滅菌生理鹽水；戊巴比妥鈉。

1.3 主要儀器設備 普通光學顯微鏡（日本 Olympuls），CT（Somatom Sensation 16排螺旋CT），噴霧吸入器，病理切片機，細菌培養(yǎng)箱，麥氏比濁儀。

1.4 實驗方法

①細菌培養(yǎng)：將粘液型綠膿桿菌接種于瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)后常規(guī)方法保存。挑取4℃保存的菌落少許，置于MH肉湯中37℃孵育過夜。配置為0.5個麥氏單位（相當于1.5X108CFU/ml）的PA菌懸液。新鮮菌懸液使用當天制備。

②動物分組：新西蘭兔經(jīng)1周飼養(yǎng)后，按體重隨機分為2組，實驗組（A組）12只，對照組（B組）12只，置于上海市公共衛(wèi)生臨床中心P2實驗室動物房內(nèi)分籠飼養(yǎng)。

③麻醉和實驗處理：經(jīng)耳緣靜脈注射2%戊巴比妥鈉lml/kg麻醉家兔。實驗組采用噴霧吸入器，使每只家兔隔日吸入1.5X108CFU/ml的菌懸液1.5ml，35天后停止噴霧吸入操作。對照組用同樣方法使家兔吸入l.5ml無菌生理鹽水。

④處理后病程動態(tài)觀察及監(jiān)測：處理后定期觀察動物的狀態(tài)、體重、體溫及血象變化。噴霧吸菌前所有兔行胸部CT掃描排除有病變兔，接種后隔日一次將所有當時存活的家兔CT掃描觀察病變。采用Sensation 16層螺旋CT機。使用兒童頭部掃描SFOV，螺旋掃描，床進15mm/周，動物俯臥位，頭先進；掃描條件：120KV,200mA；DFOV選擇100-120mm；掃描模式：1.0mm×16；肺算法(60)和標準算法重建（40）；常規(guī)層厚：3mm。

⑤病理學觀察：實驗組家兔均待其自然死亡，最后處死對照組家兔。剖胸取出肺制作病理切片，行HE染色鏡下觀察。實驗組兔肺標本行肺組織勻漿細菌培養(yǎng)鑒定。

1.5 統(tǒng)計方法 采用SPSS18.0軟件進行統(tǒng)計學處理。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

2.1 存活時間 實驗組動物存活時間21-38天不等，平均存活時間為24.9天。有2只兔麻醉意外死亡，其余兔自然死亡時均形成不同程度的綠膿桿菌肺部感染。

2.2 觀察項目 A組新西蘭兔早期有明顯寒顫、發(fā)熱、喘息急促、亢奮恐慌，后期出現(xiàn)反應遲鈍、毛發(fā)粗糙黯淡、營養(yǎng)狀態(tài)差，平均體重下降明顯。B組新西蘭兔未見明顯異常。經(jīng)耳緣靜脈采血送檢實驗室檢查，A組新西蘭兔經(jīng)處理后外周血白細胞總數(shù)顯著升高，B組未見明顯改變。

2.4 胸部CT掃描 A組胸部CT出現(xiàn)斑片狀模糊影、支氣管充氣征、片狀實變、結節(jié)影、胸膜增厚等肺部感染改變，少數(shù)出現(xiàn)支氣管擴張(圖1、2)。B組胸部CT未見明顯異常。

2.5 肺組織勻漿細菌培養(yǎng)鑒定 A組兔死亡后取病變肺組織進行勻漿，于普通瓊脂培養(yǎng)基37℃上細菌培養(yǎng)24小時后，根據(jù)培養(yǎng)、形態(tài)及生化特性可鑒定致病菌為綠膿桿菌（圖3）。

2.6 病理學觀察

A組：吸入PA菌液后第21-28天死亡家兔肺臟表現(xiàn)有充血水腫，體積增大或正常，表面可見結節(jié)樣膿腫灶及出血點，部分可見胸腔積液(圖4)。第28天-35天死亡家兔的肺臟出血及膿腫灶減小，部分出現(xiàn)空洞性病變。第36后死亡的家兔肺臟體積減小，質(zhì)地輕度變硬(圖5)。A組HE染色后鏡下可見較多桿樣細菌菌落，部分成對或短鏈狀排列（圖6）。第21-28天肺泡腔內(nèi)大量出血、滲出，中性粒細胞浸潤、肺組織內(nèi)小膿腫形成，肺泡壁小血管擴張充血（圖7）。第21-28天有肺組織實變伴周圍肺氣腫（圖8）、細支氣管壁炎細胞浸潤，部分纖毛倒伏、脫落的表現(xiàn)。第36天后死亡兔的肺泡間隔增厚，肺間質(zhì)大量淋巴細胞浸潤，以淋巴細胞為主（圖9）。

B組：吸入無菌生理鹽水的對照組動物，肺臟大體標本外觀無異常，鏡下細支氣管以及肺泡結構正常，肺泡腔內(nèi)未見炎性滲出。但是其中有2只肺間質(zhì)內(nèi)少到中量炎細胞浸潤。

討 論

醫(yī)院獲得性肺炎（HAP）的病原微生物以革蘭陰性桿菌為主（占50-70%），國內(nèi)外報道均以銅綠假單胞菌綠占首位[2]。銅綠假單胞菌（又稱綠膿桿菌）屬于條件致病菌，廣泛存在于濕潤的自然環(huán)境、機體體表及與外界相通的腔道內(nèi)，可在人體呼吸道、會陰部、 腋窩等處定植。機械通氣患者的下呼吸道、燒傷患者的皮膚、使用廣譜抗生素治療患者的黏膜皮膚等處都可有PA的定植[3]。由于該細菌表面有一層生物被膜，不易被吞噬細胞吞噬和抗生素抗生素滲透殺滅，且綠膿桿菌天然有染色體介導的多重耐藥特性，在使用抗菌藥后易發(fā)生獲得性耐藥，是下呼吸道感染難治性常見致病菌[4]。院內(nèi)感染患者基礎疾病較多，免疫力低下，加上氣管切開、插管、機械通氣和慢性阻塞性肺部疾病等造成的支氣管粘膜纖毛機制缺陷、功能不全的因素，造成黏附于上皮細胞的綠膿桿菌不能被有效地捕獲或趨送，為綠膿桿菌的長期定植創(chuàng)造了條件[5]。一旦發(fā)生定植就不易清除，可形成慢性炎癥。

目前肺部感染動物模型的肺部細菌接種常見方法有氣管切開術注入、氣管插管注入、霧化吸入、經(jīng)皮氣管穿刺注入、經(jīng)鼻咽滴入等方法[6,7]。Cash等[8]學者首先報道了小鼠肺部銅綠假單胞菌慢性感染模型。他們將小鼠氣管切開后，進行插管注入銅綠假單胞菌的瓊脂包裹體，成功地將細菌接種至小鼠肺部造成感染。有學者使用免疫抑制小鼠氣管插管接種粘液型PA菌，發(fā)現(xiàn)免疫抑制狀態(tài)下PA菌能導致多器官嚴重的急性炎癥反應[9]。國內(nèi)有學者曾采用霧化吸入法對老齡家兔反復感染綠膿桿菌，建立了家兔穩(wěn)定的慢性綠膿桿菌肺部感染模型[10]。但是氣管切開易造成傷口感染、出血較多等并發(fā)癥，氣管插管有創(chuàng)傷性風險且操作相對復雜，經(jīng)皮氣管穿刺注菌的準確定位一定程度上依賴于操作手法嫻熟與否。操作易造成其他病原菌混合感染并且術后動物生存時間較短。考慮到上述方法的創(chuàng)傷性、操作性，而本研究使用免疫正常的新西蘭兔，通過經(jīng)鼻噴霧吸入方式接種細菌，更安全、真實的模擬了綠膿桿菌呼吸道感染的自然途徑與急慢性病程，建立了家兔綠膿桿菌肺炎急慢性病程演變模型，并以影像學、病理學及病原微生物學三方面作為造模成功判斷標準。

本研究結果表明，接種PA菌懸液后，多數(shù)動物早期出現(xiàn)了諸如高熱、外周血白細胞總數(shù)升高的急性細菌感染癥狀和出血、肺水腫、中性粒細胞浸潤、膿腫灶形成的病理改變。隨著細菌的反復接種，逐漸出現(xiàn)較多的慢性炎癥及在慢性炎癥基礎上急性發(fā)作的病理改變。停止吸菌后這種慢性炎癥改變長時間持續(xù)存在，出現(xiàn)非可逆性病理變化的原因可能是PA菌可能以生物被摸的形式長期存活于呼吸道和肺組織表面，與有關文獻報道的臨床情況相符。病理鏡下觀察顯示，吸入PA菌液后第21-28天肺部急性炎性病理改變，35天后以慢性炎癥病理變化為主。肺組織勻漿細菌培養(yǎng)結果表明家兔肺部感染的致病菌可定性為綠膿桿菌。在肺炎早期排查、輔助定性診斷、病程監(jiān)測及預后判斷中影像學起著重要作用，本研究中吸菌后第7天實驗組1號兔胸部CT可見雙上肺有明顯的斑片狀密度增高影，并見支氣管充氣征，從而說明CT對家兔綠膿桿菌肺炎的早期診斷是有價值的[11,12]。

本實驗通過采用噴霧吸入方法建立了家兔綠膿桿菌肺炎模型，并以影像學、病理學及微生物學標準，證實了綠膿桿菌能在新西蘭兔體內(nèi)造成急慢性感染病程中相應的病理改變，與在人體的致病機制有明顯的相似性，因此可以用于綠膿桿菌肺部感染的發(fā)病機制、病理改變、藥物療效觀察以及診斷、治療的研究。

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