許榮芬 潘國慶 張翔凌

Semaphorin 5A基因是神經(jīng)導(dǎo)向分子Semaphorins家族的成員之一，最初的研究資料顯示，Semaphorin 5A在中樞神經(jīng)發(fā)育過程中起著重要的作用[1]。最近，Pan[2]等研究發(fā)現(xiàn)Semaphorin 5A在胃癌組織中高表達(dá)，其表達(dá)水平與胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。然而，Semaphorin 5A在胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移過程中的作用機(jī)制，目前尚未被研究。

在我們的研究中，我們運(yùn)用RNA干擾技術(shù)，建立穩(wěn)定Semaphorin 5A表達(dá)抑制的胃癌細(xì)胞株，研究Semaphorin 5A對MMP2、MMP9表達(dá)的影響；應(yīng)用抗MMP2、MMP9抗體，檢測其對Semaphorin 5A基因介導(dǎo)的胃癌細(xì)胞侵襲能力的影響，以探討Semaphorin 5A在胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移過程中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

胃癌細(xì)胞株SGC7901來源于上海生物研究所，該細(xì)胞株被維持在含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5%C02、飽和濕度環(huán)境的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 小干擾RNA質(zhì)粒的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染

針對Semaphorin 5A基因，設(shè)計(jì)有效干擾序列：sense5′-CACCGCATCCAGTCATCTCCTATATTCAAGA CGTATAGGAGATGACTGGATGTTTTTTG-3′；antisense 5′-AGCTCAAAAAACATCCAGTCATCTCCTATACGTCTT GAATAT AGGAGATGACTGGATGC-3′，同時(shí)設(shè)計(jì)與鼠、兔、人基因無同源性列的混雜序5′-AATCGCATAGCGTATGCCGTT-3′，作為陰性對照組。這些寡核苷酸退火后，與載體pGenesil-1.1連接并轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞中，應(yīng)用脂質(zhì)體2000將干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)入胃癌細(xì)胞株SGC7901中，并進(jìn)行G418篩選和驗(yàn)證。將pGenesil-siSema5A、pGenesil-siSrcambled表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞株SGC7901，并命名為SGC7901-Sema5A-si和對照組SGC7901-Scram-si。Semaphorin 5A在這些細(xì)胞中的表達(dá)水平，通過Western blotting檢測驗(yàn)證。

1.3 Western 蛋白印跡分析

在培養(yǎng)細(xì)胞中加入200 μL 裂解液,置于冰上30 min 后吸出裂解液,于4 ℃、13 000 rpm 離心20 min,吸取上清于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?制備10%的SDS 聚丙烯酰胺凝膠,取25 μg 蛋白樣品與樣品緩沖液混合,100℃變性5 min 后點(diǎn)樣并電泳； 轉(zhuǎn)膜后用5%的脫脂奶粉封閉2 h；加一抗室溫孵育2 h，所用抗體為鼠抗人Semaphorin 5A 抗體(1∶400，Santa Cruz Biotechnology)、兔抗人MMP2和MMP9抗體(1∶400，Santa Cruz Biotechnology)、鼠抗人actin 抗體(1∶1000；Neomarker 公司)；TBST洗膜3次后，分別加辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG 或兔抗鼠IgG(1∶2000 Santa Cruz Biotechnology)室溫孵育1 h。按照ECL 檢測試劑盒(Pierce,Rockford,美國)說明書進(jìn)行顯色、曝光、X 光片沖洗；將X 光片透視掃描后,印跡的灰度值經(jīng)Gel-Pro Analyzer 軟件分析(United Bio.,美國),并以β-actin 的灰度值作為內(nèi)參，進(jìn)行結(jié)果的均一化處理,得到Semaphorin 5A的相對灰度值。

1.4 RT-PCR分析

應(yīng)用Trizol試劑處理胃癌細(xì)胞，并進(jìn)行總mRNA提取，取5 μg RNA，采用隨機(jī)引物法按試劑盒說明書進(jìn)行合成cCDA,以β-actin基因作為內(nèi)參照進(jìn)行PCR。引物由上海生工生物工程公司合成，MMP2引物序列：上游 5'-GCTACGATGGAGGCCCTAATG-3'；下游5'-TCTCCTTGGGGCAGCCAT-3'，擴(kuò)增長度236 bp。MMP9引物序列：上游5'-CACTGTCCACCCCTCAGAGC-3'；下游 5'-GCCACTTGTCGGCGATAAGG-3'， 擴(kuò)增長度 178 bp。β-actin引物序列：上游5'-CACGCACGATTTCCCGCTCGG-3'；下游 5'-CAGGCTGTGCTATCCTGTAC-3'，擴(kuò)增長度217 bp。PCR擴(kuò)增條件：①94 ℃預(yù)變性4 min；②94 ℃變性20 s，60 ℃退火25 s，72 ℃延伸25 s，共35個(gè)循環(huán)；③72 ℃延伸10 min；反應(yīng)體系為50 μl。

1.5 ELISA實(shí)驗(yàn)

收集被檢測的胃癌細(xì)胞株的上清液，4℃超速離心機(jī)14 000 rpm 10 min，收集上清液稀釋后采用ELISA方法檢測，檢測步驟嚴(yán)格按ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

在Transwell下室加入10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，作為遷移誘導(dǎo)因子,在Transwell上室滴加200 μl 1×104胃癌細(xì)胞懸液。將上室置于下室之中,在37 ℃溫箱孵育24 h后取出上室,經(jīng)PBS洗滌后,用4%多聚甲醛固定遷移至上室外表面上的細(xì)胞,HE 染色,計(jì)算遷移細(xì)胞數(shù),結(jié)果取上、下、左、右、中5 個(gè)視野( 400×)細(xì)胞計(jì)數(shù)的平均值。

1.7 Transwell 小室侵襲實(shí)驗(yàn)

在Transwell小室濾膜上鋪以300 μg matrigel基質(zhì)膠，于37 ℃下重建基膜，在超凈臺內(nèi)風(fēng)干2 h。收集被檢測細(xì)胞，用含1%的胎牛血清DMEM配置密度為1×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，下室加含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基600 μl，上室加入100 μl細(xì)胞懸液，37℃培養(yǎng)36 h，侵襲濾膜下面的細(xì)胞用結(jié)晶紫染色后，隨機(jī)選擇5個(gè)200倍顯微視野，以穿膜細(xì)胞的平均數(shù)來表示被檢測胃癌細(xì)胞的侵襲能力。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 Semaphorin 5A穩(wěn)定表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞株的建立

采用Western blotting方法，檢測Semaphorin 5A在轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞克隆中的表達(dá)，結(jié)果顯示：Semaphorin 5A在pGenesi1-Scrambled轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆(SGC7901-Scram-si)中表達(dá)水平，明顯高于pGen-1-Sema 5A轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆(SGC7901-Sema5A-si)(P<0.01)，表明成功構(gòu)建了Semaphorin 5A基因穩(wěn)定表達(dá)抑制的胃癌細(xì)胞株。

2.2 MMP9、MMP2在胃癌細(xì)胞株SGC7901-Sema5A-si、SGC7901-Scram-si中的表達(dá)

采用RT-PCR、Western blotting、Elisa等方法，檢測MMP9、MMP2在胃癌細(xì)胞株SGC7901-Sema5A-si、SGC7901-Scram-si中的表達(dá)。RT-PCR、Western blotting檢測結(jié)果顯示： MMP9在胃癌細(xì)胞株SGC7901-Sema5A-si中呈低表達(dá)，在SGC7901-Scram-si中呈高表達(dá)，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；MMP2在2種細(xì)胞株中均有表達(dá)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Elisa檢測結(jié)果與RT-PCR、Western blotting檢測結(jié)果一致(圖1)。

圖1 MMP9、MMP2在SGC7901-Scram-si 、SGC

2.3 MMP2、MMP9表達(dá)對Semaphorin 5A介導(dǎo)的胃癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響

SGC7901-Sema5A-si侵襲和轉(zhuǎn)移能力明顯低于SGC7901-Scram-si胃癌細(xì)胞株(P<0.05)；MMP9抗體能夠降低SGC7901-Sema5A-si、SGC7901-Scram-si胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，MMP9抗體處理后SGC7901-Scram-si細(xì)胞侵襲和遷移能力分別降低了61%和64%(P<0.01)，而SGC7901-Sema5A-si胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力僅降低了44%和41%(P<0.05)(圖2，3)；MMP2抗體對2種細(xì)胞的侵襲和遷移能力無影響(實(shí)驗(yàn)結(jié)果未顯示)。結(jié)果表明，MMP9抗體能夠抑制SGC7901-Sema5A-si、SGC7901-Scram-si胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，且其抑制力與Semaphorin 5A表達(dá)水平相關(guān)。

圖2 MMP9抗體對Semaphorin 5A介導(dǎo)的胃癌細(xì)胞侵襲能力的影響

3 討論

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，在世界范圍內(nèi)每年大約有876000胃癌患者被確診，它是導(dǎo)致癌癥患者

圖3 MMP9抗體對Semaphorin 5A介導(dǎo)的胃癌細(xì)胞遷移能力的影響

死亡的第二大主要原因，僅次肺癌[3]。盡管目前醫(yī)療和診斷水平取得較大的進(jìn)步，然而胃癌患者的預(yù)后依然不很樂觀，究其原因，主要因?yàn)槲赴┑陌l(fā)病因素和分子機(jī)制目前尚還十分清楚。因此，識別和尋找與胃癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)新的癌基因以及研究胃癌的發(fā)病機(jī)制，都將有重大的臨床意義。

Semaphorins是1個(gè)神經(jīng)軸突導(dǎo)向分子大家族，包括30多個(gè)成員,它們在結(jié)構(gòu)上具有一定的相似性，即在N-端含有一個(gè)高度保守的、富含半胱氨酸殘基的"Sema"域，長度約400～500氨基酸。根據(jù)種屬不同、結(jié)構(gòu)的相似性，將Semaphorins分為8個(gè)亞家族[4]。最初的研究認(rèn)為，Semaphorins家族成員與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程密切相關(guān)，調(diào)控軸突的生長方向，抑制軸突分支，誘導(dǎo)軸突進(jìn)入某些特定的靶區(qū)[5]。然而，目前越來越多的研究資料表明，部分Semaphorin家族成員在神經(jīng)系統(tǒng)以外不同組織中表達(dá)，參與了中樞神經(jīng)系統(tǒng)以外的多種活動，其中最令人注意的是這些成員在人類多種腫瘤組織中表達(dá)，調(diào)控腫瘤的發(fā)生和影響腫瘤的形成進(jìn)程[6，7]。Semaphorin 5A是Semaphorin家族成員之一，Pan等研究發(fā)現(xiàn)Semaphorin 5A在胃癌組織中高表達(dá)，其表達(dá)水平與胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。然而，Semaphorin 5A在過程中的分子機(jī)制目前還不清楚。MMPs是體內(nèi)重要的一類蛋白水解酶，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中幾乎能降解ECM的所有成分，而且還對腫瘤微環(huán)境的維持和促進(jìn)腫瘤生長起著重要作用[8]。為了探討Semaphorin 5A在胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移過程中的分子機(jī)制，我們初步研究MMP2、MMP9與Semaphorin 5A的關(guān)系。我們的研究發(fā)現(xiàn)， MMP9在Semaphorin 5A表達(dá)抑制的胃癌細(xì)胞株SGC7901-Sema5A-si中呈低表達(dá)，在對照組胃癌細(xì)胞株SGC7901-Scram-si中呈高表達(dá)，并且其表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而MMP2在2種細(xì)胞中的表達(dá)水平無明顯差異。為了更進(jìn)一步探討MMP2、MMP9表達(dá)與Semaphorin 5A在胃癌發(fā)展中的關(guān)系，我們使用MMP2、MMP9抗體處理SGC7901-Sema5A-si、SGC7901-Scram-si胃癌細(xì)胞，觀察其對Semaphorin 5A介導(dǎo)的胃癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響，結(jié)果顯示MMP9抗體能夠抑制SGC7901-Sema5A-si、SGC7901-Scram-si胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，并且抑制效果與Semaphorin 5A的表達(dá)水平相關(guān)，而MMP2抗體不能阻止SGC7901-Sema5A-si、SGC7901-Scram-si的侵襲和遷移能力。

總之，我們研究結(jié)果顯示，Semaphorin 5A通過MMP9的表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞的運(yùn)動和侵襲能力，在胃癌的發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用，這不但增加了對Semaphorin 5A基因在神經(jīng)系統(tǒng)外功能的更多了解，而且揭示了其在胃癌發(fā)生、發(fā)展的作用機(jī)制，為胃癌診斷和基因靶向治療提供了理論依據(jù)，為胃癌臨床進(jìn)展分期提供可靠的分子標(biāo)志物。

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