王松柏，翟秀珍，曹懷宇，張艷麗

（1.中國人民解放軍第251醫(yī)院麻醉科，河北 張家口075000；2.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，張家口075000）

膿毒癥及膿毒癥休克是燒傷、嚴(yán)重創(chuàng)傷和感染性疾病的常見并發(fā)癥.細(xì)胞信號通路與膿毒癥關(guān)系的研究方興未艾.研究表明MAPK（mitogen activated protein kinase）信號通路在炎癥反應(yīng)、細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞遷移、凋亡等方面起著重要作用［1］.體外實(shí)驗(yàn)表明MAPK活化促使誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶 （i NOS）及一氧化氮 （NO）合成增加［2］，參與介導(dǎo)膿毒癥發(fā)生和發(fā)展.然而，MAPK通路活化、i NOS和NO表達(dá)及膿毒性休克循環(huán)障礙三者之間的相互關(guān)系尚不清晰.本研究旨在通過抑制p38 MAPK信號通路，探討MAPK通路對組織中i NOS基因表達(dá)和NO含量的影響，并觀察其及對循環(huán)動力學(xué)的影響.

1 材料與方法

1.1 動物模型制作

2月齡的雄性清潔級SD大鼠 （中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物繁育場），飼養(yǎng)2周后體質(zhì)量 （215±24）g，實(shí)驗(yàn)前禁食1 d，自由飲水.參照Chaudry報(bào)道方法行盲腸結(jié)扎穿孔術(shù) （CLP）制造膿毒癥模型［3］.方法如下：在SD大鼠腹腔注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%戊巴比妥鈉 （80 mg／kg）后固定，鋪無菌洞巾.沿腹正中線切口，結(jié)扎盲腸根部，用18號針在盲腸上穿刺3次形成盲腸漏，逐層縫合腹壁切口.術(shù)畢立即在動物皮下注射林格氏液15 mL抗休克.

1.2 動物分組

64只大鼠隨機(jī)分成4組：①正常組：8只，麻醉后即刻處死；②假手術(shù)組：8只，麻醉后切開腹壁后立即縫合，2 h后處死；③膿毒癥組 （CLP組）：24只，分別于CLP后2、6、24 h各處死8只；④治療組：24只，術(shù)前12 h灌胃給予SB203580（Promega公司，美國），分別在CLP后2、6、24 h各處死8只.各組大鼠活殺后立即留取主動脈和肺組織凍存于液氮中；同時(shí)抽取動脈血離心收取上清液凍于－20℃冰箱中；一并待測.

1.3 血清和組織NO水平

稱取適量血管或肺組織，與磷酸鹽緩沖液一起置于勻漿器中冰浴勻漿，離心提取上清液，與血清一并嚴(yán)格按NO測定試劑盒 （北京晶美）說明書操作測定NO含量.

1.4 組織i NOS mRNA測定

取適量肺或血管組織，采用異硫氰酸胍一步提取法提取組織總RNA，參照試劑盒 （Pr o mega美國）說明書半定量法 （RT－PCR）測定總RNA純度和濃度，逆轉(zhuǎn)錄獲得并擴(kuò)增c DNA.大鼠i NOS引物序列（擴(kuò)增片段450 bp）：5′－TG－GCAGGATGAGAAGCTGAG－3′ （上游），5′－CTGGTCGATGTCAT－GAGC AA－3′（下游）；三磷酸甘油醛脫氫酶 （GAPDH）引物序列 （擴(kuò)增片段309bp）：5′－TCCCTCAAGATTGTCAGCAA－3′ （上游）；5′－AGATCCA－CAACGGATACATT－3′ （下游），由北京北方生物公司合成.i NOS擴(kuò)增條件為94℃2 min，57℃1.5 min，72℃3 min，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸15 min.擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%瓊脂糖凝膠電泳后拍照，圖像分析處理系統(tǒng) （Beck man，德國）獲取GAPDH與i NOS的積分光密度比值代表mRNA相對表達(dá)量.

1.5 平均動脈壓 （MAP，mm Hg）、脈搏 （次／min）測定

在大鼠左側(cè)頸總動脈插管連接生物信號電腦采集系統(tǒng) （Pclab，北京威信斯達(dá)）測定大鼠的MAP和脈搏.

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 肺、血管組織和血漿中NO含量的變化

正常大鼠血管和肺、血漿NO含量較少，假手術(shù)組與正常組比較差異無顯著性.與正常組相比，CLP后NO在2 h即明顯增高，6 h達(dá)到高峰，24 h仍然處在比較高的水平 （P＜0.05）.與CLP組相比，SB203580處理后，NO水平在2 h和6 h時(shí)間點(diǎn)有顯著性降低 （P＜0.05），見表1.

2.2 血管、肺組織i NOS mRNA的表達(dá)變化

正常大鼠肺和血管表達(dá)i NOS mRNA較少，假手術(shù)組與正常組相比表達(dá)無明顯差異；與正常組相比，CLP后大鼠i NOS mRNA表達(dá)各時(shí)間點(diǎn)均顯著升高 （P＜0.05）.SB203580處理后，與CLP組相比，大鼠i NOS mRNA表達(dá)在2、6 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)有顯著性降低 （P＜0.05），見表1.

2.3 脈搏和MAP變化

與正常組比較，假手術(shù)組MAP和脈搏變化不明顯，CLP后大鼠各時(shí)間點(diǎn)脈搏顯著增快、MAP顯著降低.SB203580處理后，與CLP組比較，大鼠脈搏和MAP在2 h和6 h時(shí)間點(diǎn)顯著好轉(zhuǎn) （P＜0.05），見表1.

2.4 相關(guān)分析

相關(guān)分析表明，血管和肺組織NO含量與i NOSmRNA的表達(dá)呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別是0.75和0.74；血清NO含量與血管及肺組織i NOS mRNA表達(dá)亦呈現(xiàn)較強(qiáng)正相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別是0.69和0.65（P＜0.05）.MAP與肺、血管和血漿NO含量呈顯著性負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別是－0.85、－0.86和－0.90 （P ＜0.05）.

表1 SB203580對膿毒性休克大鼠循環(huán)功能和組織NO、i NOS mRNA表達(dá)的影響 （n＝8）

表1 SB203580對膿毒性休克大鼠循環(huán)功能和組織NO、i NOS mRNA表達(dá)的影響 （n＝8）

注：與正常組比較＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與CLP組中同時(shí)相點(diǎn)比 較＃P＜0.05，＃＃P＜0.01，

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3 討 論

有文獻(xiàn)提示，敗血癥患者的病死率高達(dá)33%～40%，膿毒性休克病死率更高［4］，重癥監(jiān)護(hù)病房尤為多見，但臨床對其缺乏有效治療手段.膿毒癥休克與多種細(xì)胞信號通路及其介導(dǎo)的炎癥介質(zhì)密切相關(guān).比較明確的是CLP后大鼠組織和血清i NOS mRNA和NO水平均顯著升高，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與此基本相符，同時(shí)還觀察到血壓嚴(yán)重下降、脈搏劇烈增快，表現(xiàn)為嚴(yán)重休克.血液中的NO的含量明顯高于血管和肺組織；中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等均可合成i NOS和NO；因此，眾多器官和組織合成的NO共同釋放入血并促使血液中的NO升高.假手術(shù)組與正常組相比各參數(shù)均無顯著變化，提示感染性腹膜炎為主要影響因素，NO在其中起著重要作用.

革蘭陰性菌的脂多糖通過誘導(dǎo)i NOS高表達(dá)從而介導(dǎo)多種組織和細(xì)胞產(chǎn)生NO，i NOS催生過量NO是膿毒癥休克的重要發(fā)病機(jī)制之一［5］，大量生成的NO將導(dǎo)致血管張力下降、心臟和血管對兒茶酚胺敏感性下降以及心肌收縮力降低等一系列病理改變，并且可能是感染導(dǎo)致休克的最終共同路徑.炎癥、膿毒癥、休克與眾多細(xì)胞信號通路以及細(xì)胞因子關(guān)系錯(cuò)綜復(fù)雜，其中，MAPK信號通路是致病微生物激發(fā)機(jī)體抗感染免疫力信號傳導(dǎo)中的一個(gè)關(guān)鍵通路.LPS可通過激活MAPK通路而誘導(dǎo)i NOS的合成增加［6］，同時(shí)TNF－α和IFN－γ等與LPS可相互協(xié)同增強(qiáng)i NOS的表達(dá).并且感染可激活多種途徑誘生大量TNF－α和IFN－γ等促炎癥介質(zhì)從而直接或間接誘生NO.因此，NO的大量合成與多種機(jī)制有關(guān)，但MAPK途徑在其中有著非常重要的作用，而且抑制MAPK的活性可下調(diào)細(xì)胞i NOS的表達(dá).

SB203580為p38 MAPK的特異性抑制劑，對p38 MAPK有明顯抑制作用，進(jìn)而抑制細(xì)胞因子表達(dá).本實(shí)驗(yàn)在使用SB203580后，CLP誘導(dǎo)的肺、血管和血清i NOS mRNA表達(dá)和NO含量升高的幅度明顯減弱，且循環(huán)動力學(xué)明顯好轉(zhuǎn)，相關(guān)分析也提示NO含量與血壓脈搏具有較強(qiáng)的相關(guān)性.提示抑制p38 MAPK活化可抑制膿毒癥大鼠的i NOS表達(dá)，進(jìn)而下調(diào)NO水平，且可改善休克導(dǎo)致的循環(huán)功能不全，循環(huán)功能的好轉(zhuǎn)可能與i NOS和NO下調(diào)有關(guān).MAPK還可能通過調(diào)節(jié)其他炎癥介質(zhì)的表達(dá)，進(jìn)而影響循環(huán)功能.

但也有研究發(fā)現(xiàn)，NO升高可有助于機(jī)體殺滅致病微生物.而且實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用基因敲除的方法產(chǎn)生i NOS缺陷小鼠，結(jié)果i NOS缺陷小鼠盲腸結(jié)扎穿術(shù)后的死亡率明顯高于野生型.提示i NOS及其介導(dǎo)生成的NO對動物具有有益的一面.這些不一致的觀點(diǎn)說明NO、i NOS的調(diào)節(jié)過程非常錯(cuò)綜復(fù)雜，不同實(shí)驗(yàn)所采用的實(shí)驗(yàn)動物種屬、模型等實(shí)驗(yàn)背景不同都有可能導(dǎo)致結(jié)論迥異.

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示p38 MAPK途徑與大鼠膿毒癥的i NOS和NO誘生密切相關(guān)，并且這一作用與膿毒癥的循環(huán)功能變化密不可分，調(diào)控MAPK途徑可能將成為治療膿毒癥休克手段之一，其量效和時(shí)效關(guān)系有待于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)摸索.

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