段斯亮 于 聲 蘇曉慶

(柳州醫(yī)學高等?？茖W校病原生物學與免疫學教研室，①檢驗教研室 廣西柳州 545006;②貴陽醫(yī)學院生物學教研室)

滅蚊真菌貴陽腐霉總RNA提取方法的建立

段斯亮 于 聲①蘇曉慶②

(柳州醫(yī)學高等?？茖W校病原生物學與免疫學教研室，①檢驗教研室 廣西柳州 545006;②貴陽醫(yī)學院生物學教研室)

①目的 提取貴陽腐霉(Pythium guiyangense)的總RNA。②方法 誘導后的菌絲加入硅藻土，用液氮研磨成粉末狀，在變性劑存在的條件下，用酚/氯仿/異戊醇抽提，除去DNA和蛋白質，再用醋酸鈉和70%乙醇沉淀RNA，去除多糖。③結果 用該方法提取的RNA樣品，經紫外分光光度計檢測，OD260/OD280=1.98，OD260/OD230=2.30;1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，28SrRNA帶的亮度約為18SrRNA帶的2倍。④結論 成功地提取了貴陽腐霉總RNA，且RNA的純度和完整性很好，能夠達到進行分子生物學領域其他操作研究的標準。

貴陽腐霉 硅藻土 RNA提取

在基因表達調控研究中，RT－PCR(逆轉錄多聚合酶鏈反應)、Northern分析、cDNA文庫(含一種生物體所有基因編碼的cDNA分子的克降群)的構建等都需要高質量的RNA，獲得完整性良好的RNA已成為分子生物學各研究領域首先要解決的問題。在所有的RNA實驗中，最關鍵的因素是分離得到全長的RNA。而實驗失敗的主要原因是核糖核酸酶(RNA酶)的污染。RNA酶很穩(wěn)定，一般而言反應不需要輔助因子，而RNA制劑中只要存在少量的RNA酶就會引起嚴重的后果。目前，許多RNA提取方法已建立起來，這些方法均用到RNAase(核糖核酸酶)的抑制劑如肌鹽、酚、氯仿、氯化艷密度梯度離心等［1～3］，但是，仍有不少實驗材料由于富含RNA酶、多糖、多酚等物質或者降解RNA及與RNA形成難溶物等方式嚴重干擾RNA的提?。?，5］，常常導致實驗的失敗。我們在用RT－PCR克隆貴陽腐霉的類枯草菌素蛋白酶基因時，發(fā)現(xiàn)用一步法提取RNA，結果并不理想，污染和降解現(xiàn)象較多。為了解決上述問題，我們在參考多種RNA提取技術的基礎上，發(fā)現(xiàn)了一種簡單、有效的適合腐霉菌的RNA提取方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種。貴陽腐霉(P.guiyangense)，由本實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基。SFE 培養(yǎng)基［6］，誘導培養(yǎng)基［7］。

1.1.3 主要試劑。RNA提取液為:異硫氫酸胍6 mol/L，Tris－ HCl(pH 7.5)0.2 mol/L ，NaCl 0.5mol/L，EDTA 0.01 mol/L，SDS 1%，0.15mol/L β － 巰基乙醇;硅藻土;酚/氯仿/異戊醇(v/v 25:24:1);NaAc(3mol/L，pH5.5);70%乙醇(DEPC 水配制);異丙醇。

1.2 方法 切取1cm×1cm SFE培養(yǎng)基活化5天的菌塊，轉入100mL誘導培養(yǎng)基，26℃，110rpm振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)至所需時間，收集菌絲，用DEPC－H2O過濾沖洗干凈并濾干(盡量干燥)。置于研缽中加入硅藻土，倒入液氮研磨至粉末狀，趁液氮尚未揮發(fā)光，把粉末(約0.8g)轉移到RNase－free的1.5mL離心管中，加入1.0mLRNA提取液，劇烈振蕩混勻，冰浴15min。加入200μL酚/氯仿/異戊醇(v/v 25:24:1)混勻，冰浴 15min。4℃，12000r/min離心20min。取上清移入另一RNase－free的1.5mL離心管中，加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(v/v 25:24:1)再抽提一次;轉移上清，加入等體積冰凍異丙醇，－20℃放置60min。4℃，12000r/min離心20min。棄上清液，將RNA沉淀用DEPC－Water溶解，加入 1.5mL 3mol/L NaAc，0℃ 過夜。4℃，10000r/min離心20min。用70%乙醇洗滌沉淀2次，室溫晾干，加入30μL DEPC－Water溶解沉淀。立即使用或－70℃保存。

1.3 RNA質量的檢驗

1.3.1 RNA的純度。用BECKMAN紫外分光光度計測量樣品在 230nm、260nm、280nm 處的 OD值，計算 OD260/OD230、OD260/OD280的結果。

1.3.2 RNA的完整性。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量，28SRNA與18SRNA的亮度比約為2。

2 結果

2.1 RNA的純度 吸取1μLRNA，用99μL超純水稀釋100倍，在BECKMAN紫外分光光度計中檢測，OD260/OD280=1.98，OD260/OD230=2.30，說明RNA純度很高，無蛋白質、酚類污染。

2.2 RNA的完整性 取1μgRNA樣品進行1%瓊脂糖凝膠(含1μg/mL溴化乙錠)電泳，130v電泳40min后在凝膠成像系統(tǒng)中觀察，結果顯示28SrRNA、18SrRNA與5SrRNA帶型整齊，無拖尾，而且28S帶的亮度約為18S帶的2倍，5S帶的亮度較低，說明RNA完整性很好，點樣孔中及其附近也未發(fā)現(xiàn)有DNA的污染。見圖1。

圖1 貴陽腐霉RNA電泳圖

3 討論

貴陽腐霉是一種絲狀真菌，富含RNase、多酚、多糖。多糖具有與RNA相似的理化性質，在提取總RNA時，多糖等易與RNA一起沉淀下來，RNase易使RNA發(fā)生降解［8］。所以使用一步法提取RNA，污染和降解現(xiàn)象嚴重?？紤]到以上因素，本方法特別采用了能吸附RNA酶的硅藻土研磨。一般的提取方法都是采用液氮研磨，但由于真菌材料使用了液體培養(yǎng)，即使過濾后菌絲體仍含有較多的水分，液氮冷凍會形成冰晶而妨礙研磨。研磨時間越長，就越增加RNA酶污染的機會。而硅藻土是一種黏土，能吸附RNA酶［9］，有效抑制RNase活性，而且使得研磨過程更加容易和快速。并且實驗中把變性劑中異硫氫酸胍的濃度提高1.5倍，在細胞破碎后能強烈抑制RNase活性。一步法使用酚/氯仿/異戊醇抽提一次，DNA污染嚴重;而本方法用酚/氯仿/異戊醇多次抽提，使RNA留在水相而DNA和蛋白質進入有機相，能將蛋白質清除干凈，去除DNA污染。用醋酸鈉沉淀RNA粗品，能除去高含量的多糖，結果表明，此步的改動較一步法可除去絕大部分的多糖，且RNA樣品完好。

在檢測RNA樣品的完整性時，考慮到變性瓊脂糖凝膠電泳較麻煩，且上樣量較多，我們采用了非變性瓊脂糖凝膠電泳。從圖1中可見，RNA電泳后28S、18SrRNA與EB的結合量比值約為2:1，表明RNA未發(fā)生明顯降解;點樣孔中及其附近也未發(fā)現(xiàn)有DNA的污染;28SrRNA后拖尾，可能與上樣量較多有關，也與采用非變性瓊脂糖凝膠電泳有關。

本實驗結果表明，此方法能夠獲得高純度完整的RNA，其效果優(yōu)于傳統(tǒng)的一步法，適用于富含RNase和多糖的腐霉菌絲總RNA的提取，為貴陽腐霉功能基因的表達研究奠定了基礎，同時也為其它真菌總RNA的提取提供了一定的參考依據(jù)。

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R 392

A

2095－2694(2012)01－020－02

廣西教育廳科研項目(編號:200810MS026)，柳州醫(yī)學高等?？茖W校碩士研究生科研啟動項目(編號:2007Y01)。

(2011－08－29 收稿)(王一伊 編輯)