于麗萍，程繁銀，李亞晨，樸豐源

(1.大連大學(xué) 附屬中山醫(yī)院 內(nèi)科，遼寧 大連 116001；2.大連醫(yī)科大學(xué) 衛(wèi)生管理學(xué)教研室，遼寧 大連 116044；3.大連醫(yī)科大學(xué) 勞動(dòng)衛(wèi)生與環(huán)境學(xué)教研室，遼寧 大連 116044)

鉛是一種常見的有毒重金屬和環(huán)境污染物。隨著經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展，環(huán)境鉛污染問題日趨嚴(yán)重。鉛具有多系統(tǒng)毒性，尤其男性生殖毒性已引起關(guān)注。人群流行病學(xué)調(diào)查和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，鉛暴露不僅對(duì)精子的發(fā)生，而且對(duì)精子的發(fā)育和成熟均具有明顯的抑制作用[1-2]，但其毒作用機(jī)理目前尚不十分清楚。

附睪是精子貯藏、成熟的場(chǎng)所。由睪丸上皮生成的精子只有通過附睪后才獲得向前運(yùn)動(dòng)能力和受精能力，即達(dá)生理上的成熟[3]。本研究用組織病理學(xué)技術(shù)并結(jié)合Western blotting、免疫組化的方法，觀察鉛對(duì)雄性小鼠附睪組織Y染色體基因Ddx3y蛋白的表達(dá)影響，探討該蛋白與鉛的生殖毒性作用之間的關(guān)系，為闡明鉛的雄性生殖毒性機(jī)制以及防治鉛的生殖毒性危害提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試 劑

醋酸鉛(上?；瘜W(xué)試劑廠)；RIPA強(qiáng)裂解液(碧云天生物技術(shù)研究所)；一抗為小鼠單克隆抗體(美國(guó)SANTA CRUS公司)；二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(美國(guó)Sigma公司)；超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；DAB試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 動(dòng)物的選擇和飼養(yǎng)

健康昆明種雄性小鼠48只，體重(20±2) g，由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。按體重將小鼠隨機(jī)分為4組，每組12只。即對(duì)照組、0.5 g/L醋酸鉛染毒組、1 g/L醋酸鉛染毒組和1.5 g/L 醋酸鉛染毒組。飼養(yǎng)小鼠的室內(nèi)條件如室溫(22±2) ℃、濕度(60±5) %等被嚴(yán)格監(jiān)控，小鼠可以任意飲水和取食(標(biāo)準(zhǔn)食物)，連續(xù)染毒60 d。

1.3 組織形態(tài)學(xué)觀察

取附睪組織，經(jīng)多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，顯微鏡下進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察。

1.4 Western blotting測(cè)定Ddx3y蛋白表達(dá)

將附睪組織在液氮中研磨，組織勻漿器勻漿，用RIPA強(qiáng)裂解液(碧云天生物有限公司)4 ℃裂解細(xì)胞30 min，在使用前數(shù)分鐘加入PMSF，13 000 r 20 min離心提取組織總蛋白, BCA試劑盒對(duì)蛋白進(jìn)行定量，β-actin作為內(nèi)參，蛋白樣品經(jīng)10% SDS-PAGE電泳分離，電泳結(jié)束后濕式轉(zhuǎn)膜20 min，抗體結(jié)合，ECL顯色發(fā)光，UVP掃描分析。一抗為小鼠單克隆抗體(美國(guó)SANTA CRUS公司，sc-11023)，稀釋度為1∶1500 (v/v)，β-actin一抗為鼠抗鼠單克隆抗體(美國(guó)Sigma公司)，稀釋度為1∶1500 (v/v)。二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(美國(guó)Sigma公司),稀釋度為1∶5000(v/v)。

1.5 免疫組織化學(xué)方法觀察附睪組織

將切片放入裝有抗原修復(fù)液的容器中，至微波爐加熱，使容器內(nèi)液體溫度保持在92～98 ℃，并持續(xù)10～15 min。5%～10%正常山羊血清封閉，室溫孵育15 min。傾去血清，滴加一抗為小鼠單克隆抗體，稀釋度為1∶80 (v/v)，37 ℃烤箱2 h。PBS漂洗后，滴加二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，37 ℃烤箱10 min。滴加DAB顯色液顯色10 min，自來水充分漂洗，蘇木素復(fù)染1 min，二甲苯透明，中性樹膠封片，進(jìn)行圖像采集。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

計(jì)量資料結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示，應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素方差分析和組間比較采用SNK-q檢驗(yàn)法分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 附睪組織病理學(xué)觀察

對(duì)照組可見附睪管中位于基膜上的一行排列整齊的小圓形細(xì)胞核的基細(xì)胞，附睪管結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)含大量精子和分泌液(圖1A)。而染鉛組附睪管內(nèi)精子數(shù)和分泌液均減少，尤其 1.5 g/L染鉛組最為明顯(圖1D)。

圖1 小鼠附睪組織形態(tài)學(xué)變化(HE染色)Fig 1 Morphological changes in the epididymis of mice (HE staining)A為對(duì)照組；B為0.5 g/L 染鉛組；C為1.0 g/L 染鉛組；D為1.5 g/L染鉛組sp: sperms； pc: principal cells； L: seminiferous lumen. Scale bars, 50 μm

2.2 醋酸鉛對(duì)附睪組織Ddx3y蛋白表達(dá)影響

Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，醋酸鉛染毒組小鼠附睪組織中Ddx3y蛋白表達(dá)顯著低于對(duì)照組，并隨染鉛劑量的增加而降低，其中1.5 g/L染鉛組Ddx3y蛋白表達(dá)量降低最為明顯(P<0.01)。β-actin作為內(nèi)參(圖2、圖3)。

2.3 附睪組織的免疫組織化學(xué)觀察

附睪免疫組化結(jié)果顯示，抗Ddx3y蛋白免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞均呈棕黃色，免疫反應(yīng)特異性產(chǎn)物主要分布在基細(xì)胞胞核周圍，各組均可見輸精管中有少量精子。染鉛組可見，隨著染鉛劑量的增加，抗Ddx3y蛋白免疫反應(yīng)強(qiáng)度逐漸降低(圖3)。

3 討 論

Telisman[4]對(duì)101名接鉛工人進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)血鉛與精液量、精子密度、精子活力和精子活率呈明顯負(fù)相關(guān)。Wadi等[5]用含不同濃度鉛的飲水飼養(yǎng)雄性成熟小鼠6周，結(jié)果顯示鉛暴露組附睪內(nèi)精子數(shù)量明顯減少，精子數(shù)量和活動(dòng)精子所占比例降低。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，染鉛組附睪管內(nèi)精子數(shù)顯著低于對(duì)照組，與上述流行病學(xué)調(diào)查和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，提示鉛暴露對(duì)精子的發(fā)育、成熟均具有明顯的抑制作用。

圖2 各劑量組小鼠附睪組織中Ddx3y蛋白表達(dá)結(jié)果Fig 2 Expression of Ddx3y protein in the epididymis of mice

圖3 Ddx3y蛋白在附睪組織的表達(dá)分布Fig 3 Distribution of Ddx3y protein expression in the epididymis of miceA為對(duì)照組；B為0.5 g/L 染鉛組；C為1.0 g/L 染鉛組；D為1.5 g/L 染鉛組sp: sperms; pc: principal cells; L: seminiferous lumen. Scale bars, 50 μm

長(zhǎng)期以來，Y染色體一直是男性不育遺傳因素的重點(diǎn)研究對(duì)象。1996年Vogt等將Y染色體長(zhǎng)臂上主導(dǎo)精子形成的區(qū)域分為AZFa、AZFb、AZFc區(qū)。AZFa區(qū)包含3個(gè)基因，DDX3Y (DBY)、USP9Y和UTY[6],目前認(rèn)為DDX3Y為與男性不育有關(guān)的主要候選基因。小鼠也有與人的Y染色體同源基因Ddx3y，位于Y染色體斷臂(Yp)Sxrb區(qū)間[7]。小鼠Ddx3y編碼的蛋白參與雄性生殖功能，與人類DDX3Y編碼的蛋白具有高度同源性[8]。本實(shí)驗(yàn)的Western blotting和免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果均顯示，染鉛組小鼠附睪組織中Ddx3y蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，且具有劑量-反應(yīng)關(guān)系，表明鉛對(duì)小鼠附睪組織Ddx3y蛋白表達(dá)具有明顯的抑制作用。這些結(jié)果提示，抑制附睪組織Ddx3y蛋白表達(dá)可能與鉛誘導(dǎo)雄性生殖毒性作用有關(guān)。今后，有必要從mRNA水平驗(yàn)證鉛對(duì)Ddx3y表達(dá)的影響及深入探討Ddx3y蛋白表達(dá)下調(diào)與鉛的雄性生殖毒性作用之間的內(nèi)在聯(lián)系。

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