錢知勉，張麗丹 ，馮國營，殷彥君，余獻(xiàn)丹

(1.樂清市第三人民醫(yī)院 呼吸與心血管科，浙江 樂清 325604；2. 濱州醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)學(xué)院，山東 濱州 256603)

急性肺損傷(acute lung injury, ALI)是指心源性以外的各種肺內(nèi)外致病因素導(dǎo)致的急性、進(jìn)行性、缺氧性呼吸衰竭，PaO2/FiO2比值≤300,但>200，其余指標(biāo)與急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)相同[1]。膿毒癥引起的急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征(ALI/ARDS)、膿毒性休克及多器官功能障礙綜合征(MODS)是其重要致死原因[2]。促血管生成素(Ang)是一類由血管內(nèi)皮周圍細(xì)胞分泌的糖蛋白，包括Ang-1、Ang-2、Ang-3、Ang-4[3]。其中，Ang-2由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成并儲(chǔ)存于內(nèi)皮細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞受刺激后Ang-2可被快速釋放，Ang-2與Tie-2(一類具有較高同源性的受體酪氨酸激酶)結(jié)合，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，過表達(dá)可破壞血管形成，導(dǎo)致血管通透性增高，在急性血管反應(yīng)如ALI中有重要作用。本研究通過盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)誘導(dǎo)膿毒癥制作SD大鼠ALI模型，對SD大鼠ALI中肺組織變化和血清Ang-2水平進(jìn)行研究，并探討其相互關(guān)系及影響，為防治ALI提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑

成年雄性SD大鼠45只,體重200～250 g(濱州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，隨機(jī)分為兩組，對照組10只，實(shí)驗(yàn)組35只。大鼠血管生成素2(Ang-2)ELISA試劑盒，購自美國ADL公司。

1.2 模型制備

實(shí)驗(yàn)組ALI模型制備：術(shù)前大鼠禁食12 h，禁水8 h，3%水合氯醛行腹腔麻醉，75%乙醇消毒腹部，沿腹白線中段作一長1.5 cm的切口,剪開皮膚和肌層，探查腹腔分離盲腸，在距盲腸末端1 cm處用3-0絲線結(jié)扎盲腸，注意避免結(jié)扎盲腸動(dòng)脈及引起腸梗阻，用16 G穿刺針在盲腸游離面(腸系膜對面)上貫穿3次，針孔間距約3 mm，并擠出少許內(nèi)容物，還納腸管。術(shù)畢逐層關(guān)腹，并于腹壁皮下注射林格液3 mL /100 g抗休克處理。術(shù)后自由進(jìn)食飲水。對照組假手術(shù)處理，僅做無菌開腹與盲腸翻動(dòng)。實(shí)驗(yàn)組存活23只，死亡12只，存活率65.7%。

1.3 標(biāo)本處理

分別于假手術(shù)及盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)后24 h處死全部大鼠，剪取肺組織，常規(guī)石蠟包埋，HE染色觀察肺部病理變化，用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定血清Ang-2水平，具體步驟按試劑盒說明操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 肺組織變化

對照組SD大鼠肺臟光鏡下肺組織結(jié)構(gòu)清楚，肺泡腔清晰,肺泡隔基本無水腫、炎癥等特殊改變；實(shí)驗(yàn)組光鏡下見部分肺泡萎陷，肺泡壁通透性增加，可見較多中性粒細(xì)胞及少許巨噬細(xì)胞浸潤，肺泡間隔增寬等(圖1、2)。

圖1 對照組肺組織(HE ×200)Fig 1 The lung tissues of control group(HE ×200)

圖2 實(shí)驗(yàn)組肺組織(HE ×200)

2.2 Ang-2水平檢測結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組SD大鼠Ang-2水平(10.72±1.49)ng/mL明顯高于對照組(3.87±0.26)ng/mL,P<0.01；實(shí)驗(yàn)組內(nèi)死亡組SD大鼠Ang-2水平(11.48±1.52)ng/mL亦顯著高于存活組(7.69±1.83)ng/mL,P<0.05。

3 討 論

急性肺損傷(ALI)是一個(gè)炎癥和通透性增加的綜合征，以肺泡-毛細(xì)血管膜屏障的破壞為特征，造成富含蛋白的肺泡水腫液的形成和持續(xù)的低氧血癥[4]。動(dòng)物模型的建立及應(yīng)用在了解掌握其發(fā)病機(jī)制、病理生理改變中占有重要的地位，本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?即盲腸結(jié)扎/膿毒癥型)是經(jīng)腹手術(shù)在動(dòng)物盲腸上刺孔并結(jié)扎使動(dòng)物發(fā)生組織壞死和腸源性腹腔感染導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征，進(jìn)一步發(fā)展成ALI。發(fā)病機(jī)制除了內(nèi)毒素造成以外，還存在腸道其它細(xì)菌毒素的致傷作用、手術(shù)打擊等，故此種模型病情重，肺部病理損害也明顯，是較理想的ALI模型之一[5]。

人類Ang-2基因定位于第8號染色體短臂上(8p21),由496個(gè)氨基酸組成, 人鼠同源性為85%，Ang-2能夠和血管內(nèi)皮細(xì)胞上的Tie-2受體相結(jié)合激活相應(yīng)信號通路發(fā)揮作用，導(dǎo)致血管通透性增高，增加血管滲漏，表明Ang/Tie-2系統(tǒng)在炎癥反應(yīng)內(nèi)皮細(xì)胞活化中起重要作用[6]；同時(shí)Ang-2是嚴(yán)重創(chuàng)傷后內(nèi)皮激活和功能障礙的標(biāo)志物[7]；John S Giuliano等[8]推測外周血Ang-2的水平是一個(gè)早期內(nèi)皮細(xì)胞活化及損傷的理想指標(biāo)；Gallagher等[9]發(fā)現(xiàn)，在外科ICU伴ALI/ARDS患者中，死亡組血中Ang-2水平比存活組明顯增高，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，體外用高Ang-2的血漿對內(nèi)皮細(xì)胞單層刺激可破壞其內(nèi)皮連接，血管內(nèi)皮鈣黏蛋白在內(nèi)皮連接處分布紊亂，有肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維形成，引起內(nèi)皮細(xì)胞間隙形成；與此相似，Parikh等[10]的研究首次發(fā)現(xiàn)Ang-2是膿毒癥相關(guān)肺損傷時(shí)內(nèi)皮屏障破壞的重要介質(zhì)，在氧合受損的膿毒癥患者，血循環(huán)Ang-2水平明顯增高，體外應(yīng)用患者血清可破壞內(nèi)皮細(xì)胞屏障，且內(nèi)皮屏障的破壞程度和Ang-2含量相關(guān)，由此引起肺水腫。本實(shí)驗(yàn)觀察到實(shí)驗(yàn)組SD大鼠血清Ang-2水平明顯高于對照組，死亡組水平高于存活組，說明血清Ang-2的升高與ALI嚴(yán)重程度相關(guān)，導(dǎo)致肺內(nèi)皮屏障功能和結(jié)構(gòu)的不同程度的破壞，血管失穩(wěn)，引起血管滲漏，表現(xiàn)為中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡間隔增寬等，另外血清Ang-2水平的變化對ALI病情評價(jià)和預(yù)后具有參考價(jià)值。由此可見，Ang-2確定是ALI引起肺血管滲漏的關(guān)鍵因素之一，可能利用了脂多糖及腫瘤壞死因子-a等明顯上調(diào)了肺微循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞Ang-2的表達(dá)，使血管退化，這與Parikh等發(fā)現(xiàn)Ang-2可誘發(fā)急性肺水腫的研究結(jié)果有類似性。

綜上所述，本研究盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)制造SD大鼠膿毒癥ALI模型中，肺組織中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞表達(dá)增多，血清Ang-2水平也顯著升高，表明Ang-2在膿毒癥型ALI中具有重要病理作用，血清高Ang-2水平提示預(yù)后較差，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

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