顧金萍，于 健, 王俊松，王之余，曲茂興

(1.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第二醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科， 遼寧 大連 116027；2.大連大學(xué) 附屬新華醫(yī)院 重癥監(jiān)護(hù)病房， 遼寧 大連116001)

膿毒癥(Sepsis)是由感染引起的臨床疾病，為機(jī)體局部感染，毒素吸收或者病原微生物直接入血彌漫全身所致。是嚴(yán)重創(chuàng)傷、休克、感染、外科大手術(shù)患者常見的并發(fā)癥，進(jìn)一步發(fā)展可導(dǎo)致膿毒性休克、多器官功能障礙綜合征，是臨床危重患者最主要的死亡原因之一[1]，而Sepsis是否引起死亡主要取決于機(jī)體對炎癥的反應(yīng)及其炎癥因子的釋放強(qiáng)度。目前，對膿毒癥的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，病因治療、液體復(fù)蘇、血管活性藥物治療、抗生素的使用及抗凝治療等仍然是目前的主要治療手段，盡管上述治療手段不斷改進(jìn)，但膿毒癥或膿毒性休克的死亡率仍居高不下，為30%～50%[2]。

他汀類藥物是目前廣泛應(yīng)用的調(diào)脂藥物，臨床上主要用于高脂血癥、冠心病等疾病的治療。但是近期的研究顯示他汀類藥物對內(nèi)毒素血癥的患者有益。膿毒癥是細(xì)菌感染的嚴(yán)重階段，涉及到多種炎癥因子的釋放，如腫瘤壞死因子α(TNF-α)，白細(xì)胞介素1、6、8(IL-1,IL-6,IL-8)等,而他汀類藥物改善患者的預(yù)后可能與抑制炎癥因子的釋放有關(guān)。本研究的目的是觀察他汀類藥物對膿毒癥小鼠血IL-1β濃度的影響，從而進(jìn)一步明確他汀類藥物干預(yù)炎癥過程的機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(CPL)建立膿毒癥大鼠模型，動態(tài)觀察IL-1β的變化以及阿托伐他汀對它們的影響，探討他汀類調(diào)脂藥對于膿毒癥臨床治療的應(yīng)用價值。

1 材料和方法

1.1 儀器設(shè)備

DS-88型電子秤(武漢自動化儀表廠)，TG16WS高速臺式離心機(jī)(長沙科學(xué)儀器廠)，HH-W21-600電熱恒溫水浴箱(上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠)，邁瑞MR96A酶標(biāo)儀。

1.2 試劑和材料

阿托伐他汀(立普妥)，20 mg/片，大連輝瑞制藥有限公司生產(chǎn)，批號081128。麻醉劑：3%戊巴比妥鈉。制作模型的耗材：愛惜康(黑色)編織非吸收性縫線，15 cm×60 cm，由Johnson 公司生產(chǎn)。KGERC102a凱基大鼠IL-1β ELISA 試劑盒，由南京凱基生物科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物分組及給藥

100只健康雄性S-D(Sprague-Dawley)大鼠，體質(zhì)量184～202 g，購于大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飼養(yǎng)，環(huán)境溫度22～25 ℃，空氣濕度40%～70%。每5只大鼠置一籠(475 mm×300 mm×200 mm)，在籠內(nèi)自由活動，攝取全價配合飼料(大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供)并自由飲水，自然長度的晝夜循環(huán)。按照隨機(jī)排列表法分為對照組，膿毒癥組，阿托伐他汀低劑量組，阿托伐他汀高劑量組，每組25只。對照組用淀粉40 mg/kg·d加入2 mL生理鹽水制成混懸液灌胃5 d，術(shù)前禁食12 h，腹腔注射3%戊巴比妥鈉45 mg/kg麻醉，無菌條件下取下腹正中切口2 cm，翻動盲腸后還納腹腔，逐層縫合切口，置籠內(nèi)活動，不禁飲食。膿毒癥組術(shù)前灌胃與對照組相同，采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(cecal ligation and puncture, CLP)制作膿毒癥大鼠模型。阿托伐他汀低劑量組用研缽粉碎阿托伐他汀，以20 mg/kg·d加入2 mL生理鹽水制成混懸液連續(xù)灌胃5 d，采用CLP制作膿毒癥大鼠模型。阿托伐他汀高劑量組用研缽粉碎阿托伐他汀，以40 mg/kg·d加入2 mL生理鹽水制成混懸液連續(xù)灌胃5 d，采用CLP制作膿毒癥大鼠模型[3]。

1.4 盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(CLP)

術(shù)前禁食12 h，腹腔注射3%戊巴比妥鈉45 mg/kg麻醉，無菌條件下取下腹正中切口2 cm，暴露盲腸，用絲線結(jié)扎盲腸總長度的30%[4]，注意避開系膜血管，9號注射針頭在盲腸游離端選2個相距3 mm點(diǎn)分別刺孔穿透盲腸，然后將盲腸還納腹腔，逐層縫合切口，即刻皮下注射生理鹽水3 mL/100 mg體重以補(bǔ)充術(shù)中丟失的液體。術(shù)后置籠內(nèi)活動，不禁飲食。

1.5 大鼠膿毒癥嚴(yán)重程度評分標(biāo)準(zhǔn)

采用改良的評定標(biāo)準(zhǔn)[5]進(jìn)行評分。見表1。

1.6 標(biāo)本收集

分別于術(shù)后0，3，6，12及24 h 各取5只大鼠麻醉后，剪去一側(cè)頸部外側(cè)被毛，剪開皮膚，剝離組織，找到頸靜脈或動脈后，用注射器采血，在采血管中再靜置30 min, 4 ℃以4000 r/min離心15 min, 分離出血漿后-80 ℃冰箱中保存。

1.7 標(biāo)本檢測

IL-1β應(yīng)用凱基大鼠 IL-1β ELISA 試劑盒測定。

1.8 組織病理觀察

各組分別在術(shù)后0、24 h留取空腸標(biāo)本，置10%甲醛溶液中固定，依次進(jìn)行常規(guī)脫水、石蠟包埋、制成切片、蘇木精-伊紅(HE)染色后，光鏡下觀察。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，正態(tài)分布變量多組間的比較用方差分析，非正態(tài)分布變量用秩和檢驗(yàn)，4個處理組之間均數(shù)兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)法，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠一般情況

膿毒癥大鼠逐漸出現(xiàn)活動少，不再扎堆取暖，冷漠，皮毛失去光澤，停止飲水，豎毛，有些大鼠呼吸快，眼睛變雙環(huán)，對被動仰臥無反抗，感覺遲鈍，短期內(nèi)病死率高。腹腔腸系膜充血，腸管顯著擴(kuò)張，結(jié)扎盲腸壞死，血性腹水，病灶處大網(wǎng)膜包裹不佳，肝腫大，肺表面充血明顯等。低劑量阿托伐他汀組出現(xiàn)厭食，豎毛，活動少甚至不活動等情況，腸管輕度擴(kuò)張，腹水微臭，壞死盲腸被大網(wǎng)膜及周圍腸管包裹良好，但局部可見壞死。高劑量阿托伐他汀組亦出現(xiàn)厭食，豎毛，活動少等情況，腸管輕度擴(kuò)張腹水減少，壞死盲腸被大網(wǎng)膜及周圍腸管包裹明顯，對照組沒有相關(guān)表現(xiàn)。各組大鼠膿毒癥嚴(yán)重程度評分見表2。

表2 四組大鼠膿毒癥嚴(yán)重程度評分比較Tab 2 Comparison of sepsis severity scale in four groups

1)與對照組相比，P<0.01；2)與膿毒癥組相比，P<0.01；3)與低劑量組比，P<0.01

2.2 各組血漿IL-1β濃度的比較

0 h各組血漿IL-1β濃度比較差異無顯著性意義(P=0.772，P>0.05)。對照組血漿IL-1β濃度變化不明顯，在3 h、6 h、12 h、24 h膿毒癥組和對照組、阿托伐他汀低劑量組、阿托伐他汀高劑量組比較差異均有顯著性意義(P<0.01)。膿毒癥組血漿IL-1β濃度在術(shù)后3 h顯著升高，6 h達(dá)到峰值(1373.90±495.26)ng/L之后逐漸下降。阿托伐他汀組血漿IL-1β濃度同樣在術(shù)后3 h顯著升高，在6 h達(dá)到峰值，低劑量組(876.70±137.87)ng/L，高劑量組(669.40±71.23)ng/L，較膿毒癥組明顯降低(P低=0.001，P高=0.001，P均<0.01)，差異具有非常顯著性意義。12 h阿托伐他汀高劑量組較阿托伐他汀低劑量組血漿IL-1β濃度明顯降低(P=0.002，P<0.01)，差異具有非常顯著性意義。24 h阿托伐他汀高劑量組較阿托伐他汀低劑量組血漿IL-1β濃度也有明顯降低(P=0.042，P<0.05)，差異具有顯著性意義。見表3。

表3 阿托伐他汀對膿毒癥大鼠血漿IL-1β濃度的影響Tab 3 Effect on the plasma levels of IL-1β in sepsis rat (ng/L)

1)與對照組相比，P<0.01;2)與膿毒癥組相比，P<0.01;3)與低劑量組相比，P<0.01;4)與低劑量組相比，P<0.05

2.3 大鼠大體解剖檢查

對照組無明顯病理改變。膿毒癥組均出現(xiàn)嚴(yán)重的腹腔炎癥，腹腔內(nèi)有多量渾濁膿性滲出液，可見有血性腹水，腸管水腫粘連，盲腸腫脹壞疽，肝、腎充血腫大。阿托伐他汀低劑量組膿性滲出液略少，腸管粘連較膿毒癥組輕，盲腸腫脹壞疽減輕。高劑量組較低劑量組膿性滲出液少，盲腸腫脹壞疽輕。

2.4 光學(xué)顯微鏡下小腸的病理改變

對照組腸黏膜正常。膿毒癥組腸黏膜部分上皮脫落，重度炎癥。阿托伐他汀組腸黏膜中度炎癥。高劑量組較低劑量組炎癥程度減輕。見圖1。

圖1 大鼠小腸24 h病理改變(HE ×200)Fig 1 Pathological change on small intestine of rats after 24 h (HE ×200)

3 討 論

膿毒癥是由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，其過程涉及炎癥、免疫、凝血及組織損害等一系列的機(jī)體變化，最終導(dǎo)致多器官功能衰竭。雖然近年來對人體炎癥反應(yīng)的病理生理有了突破性的認(rèn)識，并采取了一些有效的治療技術(shù)，但是重癥膿毒癥的死亡率仍然保持在40%[6]，在合并臟器衰竭和休克的患者，有些甚至已超過了50%。免疫系統(tǒng)參與了膿毒癥的發(fā)病過程，近年來的研究顯示[7]，膿毒癥表現(xiàn)為兩個階段，第一階段主要為前炎因子的表達(dá)，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，白細(xì)胞介素-1(IL-1)， 白細(xì)胞介素-8(IL-8)，白細(xì)胞介素-12(IL-12), 可能有白細(xì)胞介素-6(IL-6)的表達(dá)，對有效的炎癥反應(yīng)來說，前炎因子是有益的，但是過度的表達(dá)就導(dǎo)致了器官功能不全，增加了死亡率；而在第二階段，抗炎因子，如白細(xì)胞介素-10(IL-10)，白細(xì)胞介素-13(IL-13)，白細(xì)胞介素-4(IL-4)和前列環(huán)素E2的釋放中和了炎癥反應(yīng)，使其避免過度的表達(dá)，以致造成器官功能損害。美國學(xué)者Bone[8]于20世紀(jì)90年代中期提出了代償性抗炎反應(yīng)綜合征的假說， 指出膿毒血癥患者存在不同的免疫狀態(tài)(包括免疫抑制)，主要取決于促炎細(xì)胞因子與抗炎細(xì)胞因子的平衡，免疫抑制是由于抗炎因子占優(yōu)勢所致。20世紀(jì)70年代在對免疫應(yīng)答的研究過程中，人們從絲裂源刺激的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中發(fā)現(xiàn)了許多的具有生物活性的分子，包括IL-1，研究表明LPS是單核∕巨噬細(xì)胞合成和分泌IL-1的強(qiáng)烈刺激劑，研究IL-1在膿毒癥發(fā)病機(jī)制中的作用發(fā)現(xiàn)IL-1可通過多種途徑產(chǎn)生多種效應(yīng)來介導(dǎo)機(jī)體炎癥反應(yīng)。IL-1分子量為17.5 kD，有兩種類型：IL-1α和IL-1β，主要以IL-1β為主。所以本實(shí)驗(yàn)研究阿托伐他汀對膿毒癥大鼠IL-1β的影響，以了解阿托伐他汀是否會影響膿毒癥大鼠IL-1β水平，從而對抗膿毒癥治療有影響。

他汀類藥物是羥甲基戊二酸輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，干擾膽固醇代謝，是目前廣泛應(yīng)用的調(diào)脂藥物，臨床上主要用于高脂血癥、冠心病等疾病的治療。但是大量研究證明他汀類藥物對膿毒癥有益。首先在一些動物實(shí)驗(yàn)中得到證明，Merx等[9]采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(CLP)復(fù)制小鼠膿毒癥模型, 研究表明, 經(jīng)過他汀類藥物預(yù)處理的小鼠的平均存活率是對照組的4倍。實(shí)驗(yàn)動物制造模型的方法既往有利用細(xì)菌脂多糖誘導(dǎo)的方法。本研究采用CLP法復(fù)制膿毒癥動物模型，其機(jī)理是通過盲腸的結(jié)扎和穿孔，使有菌的腸內(nèi)容物污染腹腔造成彌漫性腹膜炎，誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)，與利用細(xì)菌脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的大鼠休克模型進(jìn)行的研究相比，更能反映膿毒癥的病理生理變化，更貼近于臨床。因?yàn)樵谂R床上調(diào)脂藥物中阿托伐他汀療效確切，應(yīng)用廣泛，所以本研究中調(diào)脂藥物選擇了阿托伐他汀，而不是其他調(diào)脂藥物。本研究結(jié)果提示膿毒癥組的大鼠逐漸出現(xiàn)活動少，不再扎堆取暖，冷漠，皮毛失去光澤，停止飲水，豎毛。阿托伐他汀低劑量組出現(xiàn)厭食，豎毛，活動少甚至不活動，腸管輕度擴(kuò)張，腹水微臭，壞死盲腸被大網(wǎng)膜及周圍腸管包裹良好，但局部可見壞死。高劑量阿托伐他汀組亦出現(xiàn)厭食，豎毛，活動少等情況，腸管輕度擴(kuò)張腹水減少，壞死盲腸被大網(wǎng)膜及周圍腸管包裹明顯。可能提示阿托伐他汀有抑制膿毒癥反應(yīng)的作用。本研究結(jié)果提示，膿毒癥組IL-1β較阿托伐他汀組均明顯升高，并且高劑量阿托伐他汀組的IL-1β低于低劑量組，提示阿托伐他汀可能具有抗膿毒癥作用。比較大鼠大體解剖發(fā)現(xiàn)對照組無明顯病理改變。膿毒癥組均出現(xiàn)嚴(yán)重的腹腔炎癥，腹腔內(nèi)有多量渾濁膿性滲出液，可見有血性腹水，腸管水腫粘連，盲腸腫脹壞疽，肝、腎充血腫大。比較光學(xué)顯微鏡下小腸的病理改變，發(fā)現(xiàn)對照組腸黏膜正常。膿毒癥組腸黏膜部分上皮脫落，重度炎癥。阿托伐他汀組腸黏膜中度炎癥。高劑量組較低劑量組炎癥程度減輕。進(jìn)一步提示阿托伐他汀可以抑制動物膿毒癥反應(yīng)，主要體現(xiàn)在動物表現(xiàn)以及血漿IL-1β的治療有益方面。不只是在動物實(shí)驗(yàn)中證明有效，越來越多的臨床研究顯示，他汀類藥物不但有降脂作用，還可以抑制炎性因子的釋放，抑制炎性細(xì)胞的黏附，降低膿毒血癥的發(fā)生率和病死率[10]。一項(xiàng)前瞻性研究證實(shí)，患有急性細(xì)菌感染的患者，若預(yù)先服用他汀類藥物，則嚴(yán)重膿毒癥的發(fā)病率及ICU住院率均下降[11]。Thomsen等[12]研究阿托伐他汀對細(xì)菌感染后患者的短期病死率沒有影響，但是卻可以明顯改善細(xì)菌感染后30～180 d的病死率 。有關(guān)他汀類藥物成為近年膿毒癥治療研究的熱點(diǎn)，其主要機(jī)制之一可能與保護(hù)血管內(nèi)皮功能有關(guān)。有臨床觀察研究表明，他汀類藥物治療對膿毒癥患者有益。Kruger等[13]對438例患者中66例 (占總?cè)巳旱?5%)入院前正在服用他汀類藥物，而且其中85%患者入院后仍繼續(xù)接受他汀類藥物治療進(jìn)行的回顧性調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物治療對膿毒癥患者有益，他汀治療組與對照組相比，28 d總病死率(10.6% vs 23.1%，P=0.022)和由膿毒癥所致的病死率(6.1% vs18.3%,P=0.014)顯著下降。Almog等[14]在對肺炎、泌尿系感染和蜂窩織炎患者(這些患者的APACHEⅡ評分11.1±7.2)的前瞻性隊(duì)列研究中也表明，他汀類藥物可降低嚴(yán)重膿毒癥發(fā)生率和ICU住院率。雖然目前大多數(shù)的研究結(jié)果支持他汀類藥物能改善膿毒血癥的預(yù)后，但需要有大樣本的前瞻性的隨機(jī)對照研究結(jié)果來證實(shí)。

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