時金艷，李鐵成,夏榮榮,許衛(wèi)國

(1、連云港市第四人民醫(yī)院，江蘇 連云港 222000;2、江蘇省疾病預(yù)防控制中心慢傳科，江蘇 南京210009)

線性探針技術(shù)用于快速篩查耐多藥結(jié)核病的研究

時金艷1，李鐵成1,夏榮榮1,許衛(wèi)國2

(1、連云港市第四人民醫(yī)院，江蘇 連云港 222000;2、江蘇省疾病預(yù)防控制中心慢傳科，江蘇 南京210009)

目的評價線性探針技術(shù)(LPA)快速篩查臨床耐多藥結(jié)核病人的效能。方法應(yīng)用病例對照研究方法，連續(xù)收集326例臨床涂陽病人的痰標本，進行傳統(tǒng)比例法藥物敏感性試驗和線性探針技術(shù)檢測利福平(RFP)和異煙肼(INH)的耐藥性，分析線性探針方法對診斷耐多藥結(jié)核病的敏感度和特異度。結(jié)果以比例法為參照，線性探針技術(shù)診斷耐多藥結(jié)核病的敏感度為70%，特異度為97%，結(jié)果無顯著性差異，報告結(jié)果時間為20d，明顯低于傳統(tǒng)藥敏試驗報告時間。結(jié)論線性探針耐多藥檢測技術(shù)特異性高，快速便捷，可以用于臨床耐多藥結(jié)核病診斷。

線性探針技術(shù)；耐多藥結(jié)核病

自1944年鏈霉素研究成功，結(jié)核病由無藥可治到有藥可治，并逐漸從長程化學藥物治療進入到短程化學藥物治療時代。由于防范控制的松懈與藥物使用監(jiān)督機制等的缺陷,有些結(jié)核病患者的療程達2年以上，其根源是耐多藥結(jié)核桿菌(MDRTB)[1]，耐多藥(MDR-TB)和嚴重耐多藥(XDR-TB)菌株的出現(xiàn)，使得結(jié)核病的有效控制更加難以實現(xiàn)。WHO已將中國列為耐藥結(jié)核病“特別引起警示的國家和地區(qū)”之一，MDR-TB這一威脅全球的公共衛(wèi)生問題已引起各國學者的廣泛關(guān)注，成為新的研究熱點[2]。

傳統(tǒng)的結(jié)核菌耐藥性檢測方法為結(jié)核菌培養(yǎng)藥敏試驗，所需時間長，不利于臨床的及時、正確診斷。近年來，隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，基于結(jié)核分枝桿菌耐藥機制的研究進展，開發(fā)了多種快速檢測結(jié)核菌耐藥性的方法，如：基因芯片技術(shù)、線性探針雜交檢測等方法，大大縮短了檢測周期，有利于臨床醫(yī)生的早期診斷和治療方案的確定，一定程度上也減輕了患者的治療費用負擔。線性探針技術(shù)操作簡單易行，采用試紙條雜交技術(shù)，通過檢測最常見的rpoB和katG/inhA基因突變，確定結(jié)核分枝桿菌對利福平(rifampicin,RFP)和異煙肼(isoniazid,INH)的耐藥性[3]，可以在24h內(nèi)出結(jié)果。本研究通過用該方法檢測326例臨床涂陽結(jié)核病人的痰標本，評價其在醫(yī)院快速篩查MDR結(jié)核病的應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 研究對象 來自連云港市區(qū)及所轄區(qū)縣的初診涂陽結(jié)核病人的涂陽痰標本。

1.1.2試劑 MTBDR-Plus Kit(Hain life science,Germany),高保真熱啟動酶 (HotStar Taq酶，Qiagen)。

1.2 方法

1.2.1 采用病例對照方法，對所有入選標本同時進行羅氏培養(yǎng)基比例法藥敏試驗和線性探針技術(shù)檢測。

1.2.2 比例法藥敏 參照WHO/IUATLD標準，培養(yǎng)采用中和離心法，培養(yǎng)陽性菌株，用接種環(huán)取一環(huán)培養(yǎng)基上的菌落，研磨后與標準麥氏管比對制成1 mg/ml菌懸液，梯度稀釋為10-2和10-4mg/ml，分別接種含 RFP(40 μg/ml)和 INH(0.2μg/ml)的羅氏固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)6周后讀菌落數(shù)，計算耐藥百分比，耐藥百分比≤1%為敏感(S)，>1%為耐藥(R)。RFP和INH同時耐藥為MDR，否則為非MDR。

1.2.3 核酸提取 1ml痰標本消化液，12000r/min離心5 min后，棄上清，加150μl無菌高純水中，充分混懸沉淀，95℃水浴20 min，之后超聲15 min,12 000r/min離心5 min后，將上清轉(zhuǎn)移到另一管，取5μl用于PCR擴增，剩余-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 PCR擴增 PCR擴增準備含有DNA聚合酶的擴增體系45μl，加5μl提取的 DNA模板，上機擴增:95℃ 15 min;95℃ 30s,58℃ 2 min,10個循環(huán);95℃25s,53℃ 40s,70℃ 40s,20個循環(huán)；70℃ 8 min。直接取擴增產(chǎn)物20μl進行雜交檢測。

1.2.5 雜交 擴增產(chǎn)物經(jīng)過化學變性后，與帶有探針固化的試紙條雜交，通過顯色反應(yīng)檢測雜交。

1.2.6 結(jié)果判定 見圖1RFP和INH突變檢測圖示，其中有3個質(zhì)控探針，1個探針(AC)是擴增對照，用于質(zhì)控擴增系統(tǒng);1個探針(CC)是用于質(zhì)控顯色反應(yīng);1個探針是特異檢測23rRNA基因(tub)。并且有24個檢測探針，1個探針是特異性檢測rpoB基因，8個rpoB野生位點探針，4個rpoB常見突變位點探針;1個探針特異性檢測katG基因，1個katG野生位點探針，2個katG突變位點探針;1個探針特異性檢測inhA基因，2個inhA野生位點探針，4個inhA突變位點探針。當任一基因的野生位點出現(xiàn)顯色缺失，并且突變位點有顯色時，認為是發(fā)生了突變，判定為耐藥;野生位點未缺失，突變位點未顯色，判定為敏感。如果擴增對照或tub對照條帶缺失，需要重復(fù)實驗;顯色反應(yīng)條帶較淺時不需重做。

1.2.7 結(jié)果分析 應(yīng)用STATA8.0軟件進行數(shù)據(jù)處理。對兩種方法檢測陽性痰標本的耐藥性檢測比較采用配對四格表資料的χ2檢驗，P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

圖1 RFP和INH突變檢測圖示

2 結(jié)果

2.1 線性探針技術(shù)與傳統(tǒng)藥敏方法檢測耐多藥結(jié)果分析 兩種方法檢測陽性臨床痰標本的結(jié)果：比例法對MDR TB檢出率為17.18%(56/326)，MTBDR-Plus方法對MDR-TB檢出率為14.72%(48/326)，通過配對四格表資料的χ2檢驗可見，兩種方法檢測耐多藥結(jié)核病的差異無統(tǒng)計學意義，符合度一致。

2.2 線性探針技術(shù)檢測利福平和異煙肼耐藥性的效能 以比例法藥敏結(jié)果為標準，線性探針技術(shù)檢測利福平的靈敏度為86%，高于異煙肼的靈敏度76%，檢測利福平和異煙肼的特異性分別為93%和95%。

2.3 線性探針技術(shù)診斷耐多藥結(jié)核病的效能 以比例法藥敏結(jié)果為標準，線性探針方法檢測MDR結(jié)核病的敏感度為70%(39/56)，特異度為97%(261/270)，陽性預(yù)測值81%(39/48)，陰性預(yù)測值94%(261/278)，見表 3。

2.4 線性探針技術(shù)檢測 MDR TB的報告時間比較痰標本從區(qū)縣運輸?shù)降厥屑墝嶒炇业闹形粩?shù)為3d，線性探針檢測報告耐藥結(jié)果時間的中位數(shù)為20d，明顯低于傳統(tǒng)藥敏試驗結(jié)果時間的中位數(shù)66d。線性探針檢測隨著工作熟練，檢測報告時間逐步縮短，最短為6d。

3 討論

耐藥結(jié)核病的早期診斷對控制耐藥結(jié)核病的傳播有重要意義。傳統(tǒng)藥敏試驗花費時間長，不能滿足臨床需要。隨著分子生物學的發(fā)展，近年來涌現(xiàn)出很多方法用于結(jié)核分枝桿菌的耐藥性檢測，基于PCR原理的線性探針方法操作簡單，可以直接檢測涂陽痰標本，在一個工作日完成耐藥性檢惻，極大縮短了耐藥性報告時間[4]。

本研究采用臨床涂陽結(jié)核病人的痰標本作標本，提取核酸DNA,PCR擴增后，通過反相雜交檢測突變檢測耐藥性。研究結(jié)果顯示，LPA檢測利福平和異煙肼的靈敏度分別為86%和76%，檢測利福平和異煙肼的特異性分別為93%和95%，與李強等研究結(jié)果相似[5]。線性探針技術(shù)檢測耐多藥結(jié)核病的敏感度達到70%，特異度達97%，準確性為81%，統(tǒng)計學結(jié)果充分表明，比例法和線性探針方法在檢測結(jié)核分枝桿菌對RFP和INH的藥物敏感性的差異無統(tǒng)計學意義。此外，線性探針技術(shù)檢測報告時間較傳統(tǒng)藥敏大為縮短，雖然線性探針技術(shù)操作可以在1個工作日完成，但是由于病人痰標本需要從區(qū)縣運輸?shù)降厥屑墝嶒炇?，實際上報告時間往往需要更多時間，研究結(jié)果顯示，線性探針平均檢測時間為20d，遠小于傳統(tǒng)藥敏結(jié)果報告的66d。但隨著工作人員的操作熟練以及流程的熟悉，在研究后期線性探針報告時間縮短至6d，極大縮短了病人耐藥診斷時間，具有一定的臨床應(yīng)用和推廣價值。此外，我們的研究表明菌株凍存的時間不會影響實驗結(jié)果，可使用保存的菌株來開展耐藥性檢測。需要注意的是，環(huán)境中的核酸可能會對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響，這對于實驗室的環(huán)境提出了更高的要求。

表1 兩種方法檢測耐多藥結(jié)核病的情況

表2 線性探針技術(shù)與比例法檢測利福平和異煙肼耐藥性結(jié)果的比較

表3 線性探針技術(shù)與比例法檢測MDR TB結(jié)果的比較

表4 傳統(tǒng)藥敏和線性探針檢測時間比較

耐多藥結(jié)核病是當前全國結(jié)核病控制的重點，快速耐藥診斷可以為耐多藥結(jié)核病人的早期治療提供科學依據(jù)，本研究結(jié)果顯示連云港市初診涂陽肺結(jié)核病人中耐多藥率為15.77%，明顯高于全國水平。如果應(yīng)用新的快速耐藥檢測技術(shù)，將對本市未來耐多藥結(jié)核病控制具有重要意義。

[1]World Health Organization.Guidelines for surveillance of drug resistance in tuberculosis[S].WHO/TB,1996.

[2]World Health Organization/IUATLD.Global Working Group on Antituberculosis Drug Resistance Surveillance[S].Guidelines for surveillance of drug resistance in tuberculosis.WHO/IUATLD,1997.

[3]Hillemann D,Weizenegger M,Kubica T,et al.Use of the genotype MTBDR assay for rapid detection of rifampin and isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis complex isolates[J].J Clin Microbiol,2005,43:3699-3703.

[4]Bang DA,Andersen B,Thomsen VO.Rapid genotypic detection of rifampin-and isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis directly in clinical specimens[J].Clin Microbiol,2006,44:2605–2608.

[5]Li Q,Zhao YL.Study of MTBDR-Plus Assay for rapid detection of Rifampin and Isoniazid resistance using 197 clinical isolations[J].Zhong Guo Fang Lao Za zhi,2009,31(12)：719-721.

Research on line probe assay for rapid detection of MDR-TB

SHI Jinyan,LI Tiecheng,XIA Rongrong,et al.The Fourth People's Hospital of Lianyungang City,Jiangsu Lianyungang 222002,China

ObjectiveTo evaluate line probe assay on the detection of multi-drug resistant tuberculosis(MDR-TB)in clinical positive sputum specimens.MethodsA prospective case-control study was conducted to compare conventional drug susceptibility testing and line probe assay(LPA)by detection of rifampin(RFP)and isoniazid (INH)resistance in 326 clinical positive sputum specimens.The sensitivity and specificity of LPA were analyzed by comparing with conventional ratio drug sensitivity testing.ResultsThe sensitivity and specificity of LPA for MDR-TB detection was 70%and 97%,respectively.There was no significant difference between the two methods.The turnaround time of LPA was 20 days which was much shorter than that of traditional DST.ConclusionLine probe assay is a reliable simple method with high specificity and can be used for rapid detection of clinical MDR-TB.

Line probe assay;Multidrug resistance mycobacterium tuberculosis

R378.91+,R446.5

A

1674-1129(2012)04-0330-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2012.04.003

十一五國家科技重大專項(2011ZX10004-902)

時金艷，女，1972年1月出生，畢業(yè)于江蘇大學醫(yī)學檢驗專業(yè)，醫(yī)學學士，主管檢驗師，研究方向：結(jié)核桿菌耐藥測序。

許衛(wèi)國,Email:jsjkmcr@163.com