陳 越， 王建國(guó)， 孫 午

(九江市第一人民醫(yī)院,江西 九江 332000)

靜脈血和鼻咽分泌物EB病毒DNA檢測(cè)結(jié)果的比較

陳 越， 王建國(guó)， 孫 午

(九江市第一人民醫(yī)院,江西 九江 332000)

EB病毒;熒光定量PCR;DNA

EB病毒 (Epstein-Barr Virus)是由Epstein和Barr發(fā)現(xiàn)的一種人類皰疹病毒，常引起傳染性單核細(xì)胞增多癥，多年來(lái)研究表明EB病毒與低分化鼻咽癌、Burkitt’s淋巴瘤、Hodgkin’s病、 胃癌等惡性腫瘤的發(fā)生也有較密切的關(guān)系。目前臨床檢測(cè)手段主要是熒光定量PCR、血清學(xué)實(shí)驗(yàn)等。本論文主要應(yīng)用熒光定量PCR探討靜脈血和鼻咽分泌物EB病毒DNA檢測(cè)的比較研究。

1 材料與方法

1.1 材料Real-time PCR試劑盒購(gòu)于全式金公司；PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自達(dá)安7600；復(fù)星超凈工作臺(tái)；基因組DNA提取試劑購(gòu)自Takara公司；RT-PCR試劑盒為Takara公司產(chǎn)品。

1.2 方法 同時(shí)收集2011年1至12月門診和住院疑似 EB病毒感染的146例患者外周靜脈血標(biāo)本及鼻咽分泌物，所有研究個(gè)體靜脈血均用一次性無(wú)菌注射器采集外周靜脈血2ml，經(jīng)枸櫞酸鈉抗凝，使抗凝劑與靜脈血充分混勻，密閉送檢。標(biāo)本立即檢測(cè)或－20℃冰箱保存6個(gè)月。咽拭子標(biāo)本也要密閉送檢。

1.2.1 DNA模板提取(1)鼻咽分泌物(咽拭子標(biāo)本)，向玻璃管中加1ml滅菌 0.9%氯化鈉溶液，浸泡咽拭子5min充分震蕩均勻，擠干咽拭子，吸取全部液體轉(zhuǎn)至1.5ml離心管中，12000r/min離心5min;棄上清，沉淀中加入 50μlDNA提取液充分混勻，100℃恒溫處理 10min，12000r/min 離心 5min，備用。(2)取全血1ml至干燥玻璃管中，加入1ml滅菌0.9%氯化鈉溶液輕搖混勻;取干燥玻璃管加入500 μl淋巴細(xì)胞分離液;將稀釋好的全血用移液器加入加有淋巴細(xì)胞分離液的試管中;2 000r/min離心20min，吸取白細(xì)胞層(從上至下的第二層)，加入1.5ml離心管中，12000r/min離心5min去上清，沉淀中加入 50μlDNA提取液充分混勻，100℃恒溫處理 10min，12000r/min離心5min，備用。

1.2.2 PCR程序與PCR反應(yīng)管中加入5μlDNA模板提取液，擴(kuò)增體系總?cè)萘繛?30μl，用已知 EBVDNA含量的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性和陰性對(duì)照，置于自動(dòng)熒光PCR儀上，93℃ 預(yù)變性 2min， 進(jìn)入循環(huán)，93℃ 45s，55℃ 60s，10 個(gè)循環(huán),93℃ 30s，55℃ 45s，30 個(gè)循環(huán)，一共 40個(gè)循環(huán)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 判定標(biāo)準(zhǔn):增殖曲線不成S型曲線或Ct值無(wú)任何數(shù)值為陰性結(jié)果，Ct值＜38為陽(yáng)性結(jié)果，38≤Ct值＜40為檢測(cè)灰區(qū)，重新檢測(cè) 2次，復(fù)檢2次Ct值無(wú)為陰性結(jié)果，復(fù)檢2次其中至少一次Ct值＜40為陽(yáng)性結(jié)果。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

疑似EB病毒感染患者鼻咽分泌物標(biāo)本陽(yáng)性檢出44例(64)，靜脈血陽(yáng)性檢出6例(61)，兩者有顯著差異(P<0.05)，見表 1。

3 討論

表1 疑似EB病毒感染患者不同類型標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果

EB病毒感染引發(fā)的相關(guān)疾病多樣，包括腫瘤性和非腫瘤性等，因此臨床癥狀也具多樣性臨床癥狀，例如發(fā)熱、咽喉痛、肝脾和淋巴結(jié)腫大等?，F(xiàn)在EB病毒感染研究逐漸引起大家的重視。EB病毒是皰疹病毒γ亞科嗜淋巴細(xì)胞病毒屬的 DNA病毒，在人群中廣泛發(fā)病，雖多呈散發(fā)性，但也可引起廣泛流行。EB病毒主要通過(guò)唾液傳播，經(jīng)輸血也可傳染[1]。

EB病毒首先在口咽部上皮細(xì)胞內(nèi)增殖，然后感染B淋巴細(xì)胞，這些細(xì)胞大量進(jìn)入血液循環(huán)而造成全身性感染。EB病毒后僅能在B淋巴細(xì)胞中增殖，可使其轉(zhuǎn)化，能長(zhǎng)期傳代并可長(zhǎng)期潛伏在人體淋巴組織中，當(dāng)機(jī)體免疫功能低下時(shí)，潛伏的EB病毒活化形成得復(fù)發(fā)感染。EB病毒長(zhǎng)期潛伏在淋巴細(xì)胞內(nèi)，是以環(huán)狀DNA形式游離在胞漿中，并整合在染色體內(nèi)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR已廣泛應(yīng)用于感染性疾病病原體的檢測(cè)和診斷[2,3]，用來(lái)檢測(cè)EB病毒DNA具有高靈敏度和高特異性，可以在感染早期明確病因，準(zhǔn)確及時(shí)地反映其在體內(nèi)的消長(zhǎng)情況，因此成為檢測(cè)EB病毒的主要常用方法。

我們使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果證實(shí)鼻咽分泌物EB病毒的檢出率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于靜脈血EB病毒的檢出率，說(shuō)明EB病毒大量存在于唾液腺及唾液中，有研究表明鼻咽癌患者EB病毒主要來(lái)自鼻咽上皮，只有少量分布于外周血白細(xì)胞中，我們實(shí)驗(yàn)充分印證此點(diǎn)。在臨床采集標(biāo)本做EB病毒檢測(cè)時(shí)取材十分重要。所以鼻咽分泌物標(biāo)本來(lái)源較好，不但陽(yáng)性率較血液標(biāo)本高，且陽(yáng)性拷貝數(shù)鼻咽分泌物遠(yuǎn)高于血液標(biāo)本，而且標(biāo)鼻咽分泌物標(biāo)本采集方便，更易于收集，所以我們建議臨床需檢測(cè)EB病毒盡量取鼻咽分泌物。雖然我們從鼻咽分泌物中檢出EB病毒陽(yáng)性率較血液標(biāo)本,但其來(lái)源或釋放的機(jī)制尚不十分清楚,可能與該法收集的鼻咽分泌物帶有較多脫落白細(xì)胞有關(guān)，也可能因病毒在鼻咽部發(fā)生持續(xù)性整合感染或者由凋亡的腫瘤細(xì)胞釋放所致，有待我們進(jìn)一步研究。

[1]李金明.實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)[M].北京:人民軍醫(yī)出版社,2007:291-298.

[2]呂世琪,張金良,閆 奇.乙肝五項(xiàng)指標(biāo)與熒光定量PCR檢測(cè)血清HBV-DNA含量聯(lián)合運(yùn)用[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2011,29(6):641-642.

[3]白雪娟,楊 敏,趙澄泉,等.對(duì)ASC-H的婦女行高危人乳頭狀瘤病毒DNA檢測(cè)的臨床意義[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2010,28(1):3-5.

R446.62，Q523+.3

B

1674-1129(2012)05-0498-02

10.3969/j.issn.1674-1129.2012.05.033