何柳媚，甄建新，徐筠娉，鄧志輝

(深圳市血液中心，廣東 深圳 518020)

南方漢族急性髓細(xì)胞白血病患者殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體基因的研究

何柳媚，甄建新，徐筠娉，鄧志輝

(深圳市血液中心，廣東 深圳 518020)

目的研究和分析南方漢族急性髓細(xì)胞白血病(acute myeloid leukemia,AML)患者殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(KIR)的基因頻率和單倍型。方法采用序列特異性引物PCR(polymerase chain reaction with sequence-specific primers,PCR-SSP)技術(shù)對南方地區(qū)76例急性髓細(xì)胞白血病患者進(jìn)行KIR基因的檢測和分析，并與77例隨機(jī)健康對照人群KIR基因頻率進(jìn)行比較。結(jié)果共檢出16個KIR基因；在AML患者中檢出15種基因型，正常人群中檢出18種基因型。結(jié)論與正常人比較，AML患者各KIR基因頻率無顯著性差異。

殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體；急性髓細(xì)胞白血病；頻率；單倍型；差異

殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體 (killer cell immunoglobulin-like receptor,KIR)，屬免疫球蛋白超家族成員，基因定位于人類第19號染色體LRC區(qū)(Human Leukocyte Receptor Complex ，LRC)。 主要表達(dá)于NK細(xì)胞和部分T細(xì)胞，可以特異性識別HLA，從而調(diào)控NK細(xì)胞核T細(xì)胞的殺傷功能。KIR基因家族目前由14個表達(dá)基因和2個假基因組成[1]。KIR具有遺傳多樣性：一方面表現(xiàn)為同一KIR基因座位包含多個等位基因，另一方面又根據(jù)KIR基因內(nèi)容和基因數(shù)目的不同分成AA和Bx兩類單倍型。隨著KIR分子生物學(xué)功能的研究深入，KIR分子在惡性腫瘤、病毒感染性疾病和自身免疫性疾病中的研究[2,3]，倍受研究者的關(guān)注。對白種人的觀察表明，白血病患者KIR 2DL2頻率增高[4]，伊朗學(xué)者報(bào)道，KIR 2DS3是急性髓細(xì)胞白血病的保護(hù)性基因[5]。然而，不同種族間KIR基因型的分布有很大差異[6]，為此我們對76例南方漢族人群急性髓細(xì)胞白血病患者進(jìn)行KIR基因分型，并與正常人群進(jìn)行比較，以探討KIR與南方漢族人群急性髓細(xì)胞白血病的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 病例組為經(jīng)臨床檢查確診為急性髓細(xì)胞白血病的76例南方漢族患者，靜脈血標(biāo)本EDTA抗凝，于-20℃冰箱中凍存。對照組77例，均為南方漢族健康人群。

1.2 主要試劑 MagneSil Genomic全血基因組DNA提取試劑盒 (美國Promega公司)；KIR geno-typing PCR-SSP試劑盒 (KIR Ready Gene,Inno-Train Diagnostik GmbH,Germany)；Taq 酶 (美 國Promega 公司)。

1.3 主要儀器 Freedom EVO 200全自動DNA工作站 (瑞士TECAN公司)；Biophotometer紫外分光光度儀(德國Eppendorf公司)；9700型PCR擴(kuò)增儀(美國 ABI公司)；電泳儀(美國 Embi公司)。

1.4 基因組DNA的提取 基于磁珠法，用TECAN DNA工作站提取基因組DNA，測定DNA濃度為30～80g/L，OD260/280為 1.65～1.90。

1.5 按基因分型試劑盒說明書操作。

1.6 PCR產(chǎn)物的電泳 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)SYBR GreenⅠ染色，用2%瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)產(chǎn)物有無及特異性條帶的片段大小，確定KIR框架基因的有無。

1.7 數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì) KIR基因頻率(GF)計(jì)算公式為：GF=1-(1-f)1/2；AML患者與正常人群KIR頻率的比較采用χ2檢驗(yàn)，軟件采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件，單倍型頻率采用直接計(jì)數(shù)法。

2 結(jié)果

2.1 AML患者與正常人群KIR基因頻率及比較：本實(shí)驗(yàn)共檢測了16個KIR基因。與正常人比較，AML患者各KIR基因頻率無顯著性差異，詳見表1。

2.2 AML患者與正常人群基因型比較 KIR分為兩種單倍型組合，AA和Bx。根據(jù)http://www.allelefrequencies.net網(wǎng)站上的KIR基因型命名，在AML患者中檢出15種基因型，在正常人群中檢出18種基因型；基因型9、10、17等8種基因型未在AML患者中檢出，7、56、94等5種基因型則未在正常人群中檢出；“New?”表示查不到相應(yīng)的GENOTYPE ID號，是新發(fā)現(xiàn)的單體型。AML患者及正常人群中最常見的基因型均為AA(1)型，但在單倍型Bx中，AML患者最常見的基因型為Bx(2)，占7.9%，正常人群最常見的則為Bx(4)及Bx(8)，占10.4%。詳見表2。

表1 AML患者與正常對照人群KIR基因頻率及差異顯著性的比較

表2 AML患者與正常對照人群KIR基因型和單倍型頻率

3 討論

目前白血病在我國是威脅兒童和青少年生命健康最常見的惡性腫瘤之一，它的發(fā)生與多種因素有關(guān)，其中一些易感基因或免疫應(yīng)答基因的表達(dá)增強(qiáng)和下調(diào)及NK細(xì)胞的功能異常在白血病的發(fā)生和發(fā)展中起到了很重要的作用[7，8]。

KIR是繼HLA之后發(fā)現(xiàn)的人類又一具有高度多態(tài)性的免疫遺傳系統(tǒng)，截止2011年1月http://www.allelefrequencies.net網(wǎng)站上已經(jīng)發(fā)布了190多個人群的KIR分布情況。由于它具有種族特異性，所以在不同種族或同一種族的不同群體中都存在很大差異。對白種人的觀察表明，白血病患者KIR 2DL2頻率增高[4]，伊朗學(xué)者報(bào)道，KIR 2DS3是急性髓細(xì)胞白血病的保護(hù)性基因[5]，中國也有文獻(xiàn)報(bào)道，北方地區(qū)白血病患者3DL和2DL1比健康對照組顯著降低[9]。KIR基因具有豐富的多態(tài)性，不同個體所攜帶的KIR基因數(shù)目和種類不同，同一KIR基因座位又有多種不同的等位基因[10]，KIR基因的多態(tài)性導(dǎo)致其在不同種族和地區(qū)人群中的分布具有顯著性差異。從生物遺傳學(xué)角度講，我國漢族人群只是文化上而非血緣上的完整群體，因此存在著遺傳結(jié)構(gòu)上的差異。根據(jù)不同文獻(xiàn)報(bào)道，不同地區(qū)KIR基因頻率存在很大差異[11,12]。

對76例南方漢族人群AML患者分析其KIR頻率，與77例正常南方漢族人群相比，無顯著性差異。這與之前報(bào)道的廣東漢族人群的結(jié)果一致[13]。但是與國內(nèi)其他地區(qū)人群的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致[9]。說明不同地區(qū)和民族人群的KIR基因和基因頻率呈現(xiàn)出很大的不同和區(qū)域特點(diǎn)。這正和中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所副研究員袁義達(dá)，在《中國姓氏：群體遺傳和人口分布》一書中指出的一致，漢族南北之間存在著遺傳結(jié)構(gòu)上的差異。以我國南方的武夷山和南嶺為界，南北兩地的漢族血緣相差甚遠(yuǎn)，南北兩地的漢族血緣比南北兩地的漢族與當(dāng)?shù)厣贁?shù)民族的差距還要大。

由AML患者與正常人單倍型頻率的圖中可看出，在AML患者中檢出15種基因型，在正常人群中檢出18種基因型；正常人中8種基因型未在AML患者中檢出，AML患者則有5種基因型未在正常人群中檢出，AML患者及正常人群中最常見的基因型均為AA(1)型，但在單倍型Bx中，AML患者最常見的基因型為Bx(2)，占7.9%，正常人群最常見的則為Bx(4)及Bx(8)，占10.4%。這種基因型的分布差異現(xiàn)象有何生理和病理意義尚待深入研究。此外，KIR與HLA均有高度的多態(tài)性，相互間作用較為復(fù)雜，有必要進(jìn)一步探討不同KIR-HLA組合模式在白血病發(fā)病中的作用。

[1]Marsh SG,Parham P,Dupont B,et a1.Killer-cell immunoglobulin like receptor(KIR)nomenclature report,2002[J].Hum lmmunol,2003,64(6):648-654.

[2]Qi Y,Martin MP,Gao X,et al.KIR/HLA pleiotropism:protection against both HIV and opportunistic infections[J].PLos Pathog,2006,2(8):0741-0745.

[3]Khakoo SI,Thio CL,Martin MP,et al.HLA and NK cell inhibitory receptor genes in resolving Hepatitis C virus infection[J].Science.2004,305(5685):872-874.

[4]Verheyden S,Bemier M,Demane C.Identification of natural killer cell receptor phenotypes associated with leukemia [J].Leukemia,2004,18(12):2002-2007.

[5]Farhad S,Nader T,Kobra-Zinat E,et al.KIR2DS3 is associated with protection against acute myeloid leukemia.[J].J Immunol,2010,1(7):8-17.

[6]Toneva M,Lepage V,Lafay G,et a1.Genomic diversity of natural killer cell receptor genes in three populations[J].Tissue Antigens,2001,57(4):358-362.

[7]Valiante NM,Lienert K,Shilling HG,et a1.Killer cell receptors:keeping pace with MHC class I evolution[J].Immnol Rev,1997,155:155-164.

[8]李 丹，郗 斌，劉海燕，等.HLA I類基因與白血病相關(guān)性研究[J].中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2005，l3:563-566.

[9]陳阿梅，郭曉明，閆文英，等.白血病患者的殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體基因多態(tài)性研究 [J].中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2007，15(1):35-38.

[10]Gardiner CM,Guetnlein LA,Shilling HG,et al.Differernt NK cell surface phenotypes defined by the DX9 antibody are due to KIR3DL1 gene polymorphism[J].J Immunol,2001,166:2992-3005.

[11]王 槊，王 玨，紀(jì) 欣，等.四川骨髓庫漢族人群KIR基因多態(tài)性研究[J].中國輸血雜志，2010，8(23):601-606.

[12]許金環(huán)，張建瓊，潘 寧，等.中國漢族人群殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體基因多態(tài)性研究[J].現(xiàn)代免疫學(xué)，2009，4(29):332-336.

[13]尹曉林，鄧蘭，郭坤元，等.廣東漢族惡性血液病患者KIR及其與HLA配伍頻率分析[J].免疫學(xué)雜志，2006，5(22):549-551.

Study on the correlation of killer immunoglobin-like receptor gene diversity with acute myeloid leukemia in the southern Chinese Han population

HE Liumei,WANG Daming,XU Yunping,et al.Shenzhen Blood Center,Shenzhen Guangdong 518020,China

ObjectiveTo investigate the distribution of KIR gene and haplotype in acute myeloid leukemia of southern Chinese Han population.MethodsA total of 76 patients with acute myeloid leukemia(AML)and 77 randomly-selected healthy controls in the southern Chinese Han individuals were subjected to KIR PCR-SSP genotyping using the inno-train commercial kit.ResultsThe frequency of KIR was not significantly different when compared to the controls.We identified a total of 15 different KIR genotypes in AML patients and 18 in the control individuals.ConclusionThere is no significiant difference between KIR and AML in the southern Chinese Han individuals.

Killer immunoglobulin-like receptor(KIR)；Acute myelocytic leukemia(AML)；Frequency；Haplotype；Difference

R733.7,R343.1+2

A

1674-1129(2012)05-0426-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2012.05.003

深圳市科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(201101023)

何柳媚，女，1980年生，漢族，2005年廣州暨南大學(xué)生命科學(xué)院碩士研究生畢業(yè)，助理研究員，主要從事免疫遺傳學(xué)研究。littleduckmei@163.com