陳東科

(衛(wèi)生部北京醫(yī)院檢驗科,北京100730)

加強形態(tài)學檢查提高細菌鑒定的準確性

陳東科

(衛(wèi)生部北京醫(yī)院檢驗科,北京100730)

細菌形態(tài)學的檢查是最基本、最簡單、最快速、最直觀、最經濟的常規(guī)鑒定方法,對鑒定細菌有“導航”的作用。細菌形態(tài)學包括細菌細胞形態(tài)學和細菌菌落形態(tài)學，正確的形態(tài)學檢驗結果是準確鑒定細菌的堅實基礎。臨床微生物檢驗技術人員必須掌握一定的形態(tài)學知識，這也是基本的從業(yè)要求。

細菌；形態(tài)學檢查；鑒定

隨著自動化細菌鑒定儀器的普及使用，細菌鑒定越來越規(guī)范，鑒定準確性有了很大的提高。但全自動細菌鑒定儀也不是萬能的，那些代謝慢、生化反應弱的細菌很難得以準確鑒定。有些實驗室由于過分依賴自動化鑒定儀，對基本的形態(tài)學特征、染色特性及鑒別性試驗(如觸酶、凝固酶、氧化酶等試驗)盡量少做或不做，以至于選錯鑒定試卡。其結果有兩種情況：一是不能鑒定，二是錯誤的鑒定結果，后一種情況很難被發(fā)現(xiàn)，較前一種結果更具危害性。如何避免上述狀況的發(fā)生，以及提高對少見菌和疑難菌鑒定的準確性，這就需要我們臨床微生物檢驗技術人員加強專業(yè)修養(yǎng)，提高業(yè)務水平，掌握包括形態(tài)學等基礎的微生物學知識。

眾所周知，鑒定細菌的原則之一就是用最少的試驗完成鑒定。細菌形態(tài)學檢查就是最基本、最簡單、最快速、最直觀、最經濟的常規(guī)鑒定方法，也是確認分離菌株的參考方法之一[1-5]。對細菌形態(tài)學的正確描述依賴于方法、培養(yǎng)基、培養(yǎng)時間、染色試劑、操作技巧等[6]。細菌形態(tài)學包括細菌細胞形態(tài)學和細菌菌落形態(tài)學[7]。

1 細菌的菌落特征

細菌在固體培養(yǎng)基表面生長形成菌落。對菌落進行描述應包括菌落大小(分大、中、小，以1mm為界)、形狀、高度、邊緣、表面狀態(tài)、密度(透明度)、硬度 (用接種環(huán)刮取菌落時的感覺)、菌落內部結構、顏色、光澤以及與培養(yǎng)基表面的黏附程度，還應包括菌落的溶血、氣味和色素產生情況等特性。觀察細菌的典型形態(tài)，應該是將細菌接種在該細菌最適生長的培養(yǎng)基上、放入該細菌最適生長環(huán)境中(包括溫度和所需氣體條件)進行孵育，孵育時間應視細菌的生長速度而定，大部分常見的細菌以培養(yǎng)24h為宜，有些細菌需要更長時間的孵育才能顯現(xiàn)出典型的菌落特征。有時為了鑒別某一種或某一類細菌，需要觀察細菌在特殊的培養(yǎng)基(包括顯色培養(yǎng)基)上或在特定環(huán)境下(氣體、溫度和光線等)培養(yǎng)的形態(tài)特征。觀察菌落特征的目的是為了對細菌進行初步鑒定。有些特征是某些細菌所特有的，具有屬或種的鑒別價值，如肺炎鏈球菌在綿羊血瓊脂平板上的臍窩樣菌落(見封三圖1所示)、伴放線凝集桿菌菌落特殊的內部結構(見封三圖2所示)、侵蝕艾肯菌的斗笠樣菌落、斯氏假單胞菌(及黃色單胞菌和金色單胞菌)的皺紋樣菌落、變形桿菌遷徙樣菌落、嗜麥芽窄食單胞菌的“貓眼”菌落、銅綠假單胞菌的水溶性色素、紫色色桿菌的脂溶性色素(見封三圖3所示)、沙雷菌的紅色色素(見封三圖4所示)、產吲哚金黃桿菌產生的吲哚氣味、嗜血桿菌產生的鼠穴氣味、諾卡菌產生的腐土氣味、厭氧菌產生的腐氨氣味、熒光假單胞菌產生的黃色熒光素、某些厭氧菌可產生磚紅色熒光素等。有些細菌產生色素受到氣體的影響(粘質沙雷菌在厭氧環(huán)境下不產色)，有些細菌產生色素受到光線的影響(某些快速生長分枝桿菌是光產色或暗產色)。對細菌菌落特征的觀察、描述和計數(shù)是細菌鑒定的第一步驟，其主要目的體現(xiàn)在以下幾方面。

1.1 對病原菌的定量或半定量分析 在對標本進行定量或半定量接種后，通過菌落計數(shù)可獲得定量或半定量結果，細菌的定量在尿液分析和療效動態(tài)觀察中具有臨床意義，半定量適用于開放性標本的結果分析(確定優(yōu)勢菌)。

1.2 病原菌的確定 開放性標本受炎癥組織周圍皮膚、黏膜的常居菌叢污染的可能性較大，觀察培養(yǎng)結果時應根據標本直接涂片鏡檢結果，結合菌落形態(tài)特征來確定病原菌。

1.3 血培養(yǎng)結果解釋 分析陽性血培養(yǎng)瓶的轉種結果時，應結合對陽性培養(yǎng)液直接涂片的鏡檢結果，如果涂片結果與培養(yǎng)結果不符，應考慮操作錯誤或是污染所致。

1.4 確定鑒定方向 根據不同培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)特征，結合革蘭染色鏡檢結果及快速輔助試驗(氧化酶、觸酶、凝固酶等)結果，可做初步判定，并確定后續(xù)鑒定方向。

2 細菌的菌體形態(tài)特征

臨床微生物學實驗室仍然使用細胞形態(tài)學的方法進行細菌鑒定，革蘭染色細胞形態(tài)學是細菌分類學的基礎。掌握細胞形態(tài)學的標準方法能夠為準確鑒定細菌提供可靠保證。很難想象革蘭染色的錯誤會導致正確的鑒定結果。對細菌菌體形態(tài)特征的觀察和描述是細菌鑒定的第二步驟，其主要目的體現(xiàn)在以下幾方面。

2.1 可解釋培養(yǎng)結果、確定鑒定方向 無論是液體培養(yǎng)(如血培養(yǎng)、標本直接增菌培養(yǎng))或是固體培養(yǎng)(接種培養(yǎng)皿)，都應該將培養(yǎng)物進行涂片、染色鏡檢確定培養(yǎng)物的性質，既可快速報告，也是為下一步的鑒定指明方向。圖5(見封三)所示為血培養(yǎng)陽性培養(yǎng)物涂片革蘭染色鏡檢結果，形態(tài)學需區(qū)分諾卡菌與放線菌，經改良抗酸染色結果為陽性(見封三圖6所示)，可確定該菌是諾卡菌屬某種。

2.2 是鑒別細菌的手段 細菌菌體形態(tài)結合菌落形態(tài)特征可對細菌進行初步鑒定。例如，在選擇性巧克力平板(加萬古霉素)上生長的草綠色溶血菌落，是乳桿菌還是腸球菌(VRE)只要涂片鏡檢就很容易區(qū)分；鮑曼不動桿與克雷伯菌屬細菌的菌落形態(tài)相似，鏡下區(qū)別前者為革蘭陰性球桿菌(接近球菌)，后者為革蘭陰性桿菌；丹毒絲菌在血平板上的菌落形態(tài)與草綠色鏈球菌很相像，但鏡下形態(tài)差別很大。圖7(見封三)所示為紅斑丹毒絲菌的革蘭染色鏡下形態(tài)。

2.3 是鑒定方向及試劑選擇的依據 葡萄球菌和鏈球菌、革蘭陽性球菌和革蘭陽性桿菌、芽孢桿菌和非芽孢桿菌、革蘭陰性球菌和革蘭陰性桿菌的鑒定方向完全不同，試劑選擇也不同，如果選錯試劑結果必然是錯誤的，有些錯誤的結果很難被發(fā)現(xiàn)，最終導致臨床治療的失敗。

2.4 是藥敏組合選擇的依據 CLSI文件規(guī)定，每一種細菌都有一定的抗菌藥物組合供選擇。要準確進行藥敏組合選擇，就必須有準確的細胞形態(tài)學結果作支持。如果把球菌和桿菌、革蘭陰性和革蘭陽性細菌混淆了，最終結果將會出現(xiàn)偏差，報告臨床的后果不堪設想。

3 菌體特殊結構的觀察

3.1 莢膜 莢膜是某些細菌在細胞壁外包裹的一層粘液性物質，一般由多糖和多肽組成。莢膜作為細菌的毒力因子有必要對其染色觀察，莢膜腫脹試驗可特異性的鑒定細菌。

3.2 鞭毛 鞭毛是細菌的運動器官，觀察細菌鞭毛對于細菌鑒定有十分重要的意義。依據鞭毛的有無、位置和數(shù)量，細菌分為無鞭毛菌、單端極鞭毛菌、單端雙鞭毛菌、單端叢鞭毛菌、周鞭毛菌、側鞭毛菌等。臨床實驗室可用動力試驗驗證細菌鞭毛的存在，但動力試驗無法代替鞭毛染色在細菌鑒定中的地位。

3.3 芽孢 芽孢是芽孢桿菌休眠期的一種特殊形態(tài)。芽孢的形態(tài)包括芽孢形狀、芽孢位置和孢子囊膨大。芽孢形態(tài)分為圓柱形、橢圓形、球形，芽孢位置分為端生、近端生、中生或近中生。根據芽孢的形態(tài)學可以對芽孢桿菌屬和梭菌屬進行初步鑒定。芽孢桿菌的鑒定有專用的試劑，不可與其他細菌的鑒定試劑混用。觀察芽孢的方法很多，有染色法和直接觀察法。但芽孢染色并不優(yōu)于革蘭染色，使用相差顯微鏡觀察芽孢優(yōu)于芽孢染色和革蘭染色。圖8(見封三)所示為艱難梭菌芽孢染色結果。

3.4 異染顆粒 異染顆粒其主要成分是多聚偏磷酸鹽，可隨菌齡的延長而變大。多聚磷酸鹽顆粒對某些染料有特殊反應，產生與所用染料不同的顏色，因而得名異染顆粒。如用甲苯胺藍、次甲基藍染色后不呈藍色而呈紫紅色。棒狀桿菌和某些芽孢桿菌常含有這種異染顆粒。常見于白喉棒狀桿菌，位于菌體兩端，故又稱極體，有助于該菌的鑒定。

4 細菌形態(tài)學是微生物實驗室報告審核的重要依據

對檢驗結果的審核是臨床微生物實驗室檢驗流程的最后一道工序，應該由技術全面的技術人員進行把關。審核報告應該從檢驗申請單、感染部位選擇、標本的采集與處理、標本直接涂片鏡檢結果的描述、標本的接種和孵育、菌落形態(tài)觀察和描述、菌落涂片鏡檢結果描述、附加試驗的選擇及結果判斷、免疫學試驗結果分析、生化試劑的選擇與結果觀察記錄、專家系統(tǒng)提示內容解讀、抗菌藥物組合的選擇和結果分析、以及室內質控結果等全過程進行綜合分析，必要時還應征求臨床醫(yī)生對疾病診斷的意見，了解患者病情及用藥的相關信息。最終鑒定結果須與形態(tài)學結果相符，如果出現(xiàn)不符合結果，尤其在藥敏試驗結果與鑒定結果相矛盾時(既無法解釋的耐藥機制)，首先應審核鑒定結果與形態(tài)學結果是否相符，如果結果不相符，應該審核整個檢驗過程，找到問題所在，并重新進入鑒定程序。

綜上所述,細菌形態(tài)學的檢查,對鑒定細菌有“導航”的作用，正確的形態(tài)學檢驗結果是準確鑒定細菌的堅實基礎。這就要求每一位從事臨床微生物檢驗的技術人員必須掌握一定的形態(tài)學知識，并在實際工作中不斷學習、總結提高，早日成為一名優(yōu)秀的臨床微生物檢驗工作者，為臨床治療感染性疾病提供優(yōu)質服務。

[1]Murray PR.Manual of clinical microbiology[M].10th ed.Washhington DC:American Society for Microbiology Press,2011:3-209.

[2]葉應嫵，王毓三，申子瑜.全國臨床檢驗操作規(guī)程[M].第3版.南京：東南大學出版社，2006:720-753.

[3]蔡文誠,蔡岳廷.實用臨床微生物診斷學[M].第10版,臺北：九州圖書文物有限公司出版,2011:1-146.

[4]過祥豹.原始標本涂片檢查對微生物檢驗全過程的導航作用.臨床檢驗雜志 2002，20(特刊)：25-28.

[5]谷海瀛.形態(tài)學檢查方法的標準化及其在細菌鑒定中的作用.中華檢驗醫(yī)學雜志 2006，29(10)：951-953.

[6]Isenberg,HD.Clinical microbiology procedures handbook [M].2th ed.Washington DC:ASM,2004.

[7]陳東科,孫長貴.實用臨床微生物學檢驗與圖譜[M].北京：人民衛(wèi)生出版社,2011:169-568.

圖1 肺炎鏈球菌

圖2 伴放線凝集桿菌(透射光×4)

圖3 紫色色桿菌

圖4 深紅沙雷菌

圖5 血培養(yǎng)-諾卡菌(革蘭染色×1000)

圖6 血培養(yǎng)-諾卡菌(改良抗酸染色×1000)

圖7 紅斑丹毒絲菌(革蘭染色×1000)

圖8 艱難梭菌(孔雀綠染色×1000)

Improvement of the bacterium identification accuracy by morphological examination

CHEN Dongke.Department of Clinical Laboratory,Beijing Hospital of the Ministry of Health,Beijing 100730,China

The bacterial morphology examination,including bacterial cell morphology and bacterial colony morphology,is a routine method for bacteria identification with simple,fast,observable,and economic characteristics and plays a"navigation"role in bacterial identification.Accurate bacterial morphology examination results are the basis for identification of bacteria correctly.Clinical microbiological technicians need to have some bacterial morphology examination knowledge to improve the accuracy of bacterial identification.

Bacteria;Morphological examination;Identification

R446.5

A

1674-1129(2012)05-0419-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2012.05.001

陳東科，1961年5月生，男，副主任檢驗師，主要從事病原微生物形態(tài)學、疑難菌鑒定、抗生素藥效學研究。