鐘華林 唐安洲 謝利紅

鼻咽癌是我國(guó)南方比較常見的惡性腫瘤之一，占頭頸部腫瘤發(fā)病率的首位，目前放射治療是鼻咽癌的主要治療手段。感音神經(jīng)性聾是鼻咽癌放療后常見的并發(fā)癥，其發(fā)病機(jī)理尚未明確，目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為放療后感音神經(jīng)性聾與放射線引起的耳蝸損傷有關(guān)[1～3]。而鼻咽癌放射治療后感音神經(jīng)性聾除與耳蝸的損傷有關(guān)外，是否也有蝸神經(jīng)核損傷，目前尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究以豚鼠為動(dòng)物模型，用60Coγ射線對(duì)豚鼠耳顳部進(jìn)行照射，通過(guò)觀察放療后豚鼠ABR和蝸神經(jīng)核形態(tài)學(xué)以及凋亡相關(guān)蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase 3)在蝸神經(jīng)核中的表達(dá)，初步探討60Co照射對(duì)蝸神經(jīng)核的影響，為放療引起的感音神經(jīng)性聾的中樞病變機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物分組 48只白色紅目豚鼠，體重250～300克，耳鏡檢查耳道通暢，鼓膜完整，無(wú)中耳感染，耳廓反應(yīng)靈敏，雌雄不拘。隨機(jī)分為對(duì)照組(8只)與實(shí)驗(yàn)組(40只)，實(shí)驗(yàn)組于60Coγ射線照射后1、4、7、14、30 d(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)8只豚鼠)行ABR檢查后立即處死，心臟灌流固定后取出耳蝸核，行HE及免疫組化染色。對(duì)照組不進(jìn)行60Coγ射線照射，行ABR測(cè)試后，取耳蝸核行HE及免疫組化染色，方法同實(shí)驗(yàn)組。

1.2方法

1.2.160Coγ射線照射方法 豚鼠經(jīng)1%戊巴比妥鈉(3.5 ml/Kg)腹腔注射麻醉后固定于自制固定板上，用GWXJ80型60Co遠(yuǎn)距離治療機(jī)對(duì)豚鼠右側(cè)耳顳部做一次性40 Gy60Coγ射線照射，輻射深度2.0 cm，照射范圍為2 cm×2 cm，自制鉛板遮蓋非照射部位。

1.2.2聽性腦干反應(yīng)檢測(cè) 對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組于實(shí)驗(yàn)前、實(shí)驗(yàn)組于各時(shí)間點(diǎn)分別行雙耳聽性腦干反應(yīng)檢測(cè)。將豚鼠置于屏蔽室內(nèi)，將針形正極插入顱頂正中皮下(兩側(cè)外耳道連線中點(diǎn))斜向前約0.5 cm，負(fù)極置于兩側(cè)乳突，地極置于嘴唇脂肪墊；測(cè)試儀器用美國(guó) TDT系統(tǒng)，聲刺激為短聲，最大強(qiáng)度90 dB SPL，頻率10次/秒,耳機(jī)固定于距外耳道口0.5 cm處，帶通濾波300～3 000 Hz，觀察時(shí)程20 ms，疊加次數(shù)1 024次。以引出波Ⅲ的最低刺激強(qiáng)度確定反應(yīng)閾。

1.2.3心臟灌注及組織切片 各組豚鼠完成ABR測(cè)試后，將豚鼠心臟灌流固定后，斷頭取出腦干，放置于4 %多聚甲醛磷酸緩沖液中固定24小時(shí)，常規(guī)脫水石蠟包埋,耳蝸核的定位按Voitenko等[4]制定的豚鼠腦干立體定位圖譜,將蠟塊修剪后沿面神經(jīng)根平面向后做切片，片厚5 μm，行HE染色及免疫組化染色。

1.2.4HE染色 石蠟切片依次經(jīng)二甲苯和梯度酒精脫蠟至水，蘇木素液染5分鐘，1%鹽酸酒精分化，返藍(lán)，1%伊紅染1分鐘，蒸餾水沖洗，常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片。

1.2.5免疫組織化學(xué)染色 石蠟切片脫蠟至水，用pH6.0的0.01 mol/L的檸檬酸鹽緩沖液煮沸修復(fù)抗原10分鐘，3%H2O2室溫20分鐘，山羊血清封閉20分鐘，加Caspase 3一抗(1:100)4 ℃孵育過(guò)夜，加通用二抗，室溫下孵育10分鐘，加三抗室溫下孵育10分鐘，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片。陰性對(duì)照染色切片用PBS 代替一抗，其他實(shí)驗(yàn)步驟一樣。Caspase 3的陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞漿呈棕黃色染色。通過(guò)IPP6圖像分析軟件計(jì)算其灰度值，灰度值越低，表示細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)越強(qiáng)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1ABR測(cè)試結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組豚鼠60Coγ射線照射后1、4、7、14、30 d ABR反應(yīng)閾均升高,其中，照射后4、7、14、30 d的ABR反應(yīng)閾與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)ABR波I、II、III潛伏期及I-II、II-III、I-III波間期延長(zhǎng),與對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

2.2耳蝸核HE染色結(jié)果 光學(xué)顯微鏡下見對(duì)照組豚鼠耳蝸核神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目較多,染色均勻, 胞漿豐富，尼氏體正常,胞核和胞漿無(wú)明顯有皺縮，膠質(zhì)細(xì)胞正常(圖1a)。實(shí)驗(yàn)組豚鼠耳蝸核在60Coγ射線照射后1、4、7 d神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目及染色改變不明顯，但14 d出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞腫脹,胞漿減少，著色淺淡,胞核皺縮，尼氏體減少,膠質(zhì)細(xì)胞增生，數(shù)量增多(圖1b)，30 d上述改變更加明顯(圖1c)。

2.3耳蝸核組織Caspase 3免疫組化染色表達(dá)結(jié)果 對(duì)照組豚鼠耳蝸核神經(jīng)元未見明顯陽(yáng)性表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組豚鼠耳蝸核神經(jīng)元Caspase 3呈現(xiàn)較強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，60Coγ射線照射后不同時(shí)間點(diǎn)耳蝸核神經(jīng)細(xì)胞的Caspase 3灰度值與對(duì)照組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(表2、圖2)。

表1 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組ABR 各波潛伏期(ms)、波間期(ms) 及反應(yīng)閾( dB SPL) 比較

注：*與對(duì)照組比較,P<0.05

圖1 對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組14、30天豚鼠耳蝸核HE染色結(jié)果a 對(duì)照組耳蝸核神經(jīng)元胞漿豐富，尼氏體正常(箭頭)；b 照射后14天耳蝸核神經(jīng)元胞漿減少著色淺淡，尼氏體減少(箭頭)；c 照射后30天 耳蝸核胞漿減少著色淺淡，尼氏體減少(箭頭)(HE×400)

圖2 實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組豚鼠耳蝸核Caspase 3的表達(dá)a 對(duì)照組Caspase 3無(wú)明顯陽(yáng)性表達(dá)；b 照射后4天Caspase 3陽(yáng)性表達(dá) (箭頭)；c 照射后7天Caspase 3陽(yáng)性表達(dá)(箭頭)(免疫組化×400)

組別灰度值對(duì)照組172.33±17.81實(shí)驗(yàn)組 照射后1 d136.37±24.42* 照射后4 d94.67±15.33* 照射后7 d91.40 ± 11.71* 照射后14 d110.80±4.23* 照射后30 d123.56±32.56*

注：*與對(duì)照組比較，P<0.05

3 討論

放射治療是鼻咽癌等頭頸部惡性腫瘤的主要治療手段，放射治療后導(dǎo)致感音神經(jīng)性聽力下降是其常見的并發(fā)癥。吳湘萍[ 5]對(duì)33例鼻咽癌患者行鼻咽癌常規(guī)放療，在放療結(jié)束6個(gè)月后行ABR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)患者ABR波I、II、III潛伏期及I-III波間期均延長(zhǎng)，表現(xiàn)為感音神經(jīng)性聽力下降且呈慢性進(jìn)行性進(jìn)展，而且不可逆，認(rèn)為第Ⅷ對(duì)顱神經(jīng)至橋腦水平可能受到損害。Lau等[ 6]發(fā)現(xiàn)鼻咽癌患者放療后1個(gè)月，其ABR波Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、V潛伏期延長(zhǎng)，認(rèn)為波Ⅱ潛伏期延長(zhǎng)可能與腦干耳蝸核的損傷有關(guān)。秦嶺等[ 7]也報(bào)道48例鼻咽癌患者放療前后ABR的變化,其放療前ABR正常，但放療后ABR波I、III、V潛伏期均延長(zhǎng),也認(rèn)為放療對(duì)外周聽神經(jīng)和腦干都產(chǎn)生了損害。

范靜平等[ 8 ]用60Co γ射線對(duì)豚鼠耳顳部進(jìn)行40 Gy的一次性照射后24小時(shí)，豚鼠ABR反應(yīng)閾稍有提高。在放療導(dǎo)致感音神經(jīng)性聽力下降的動(dòng)物研究中，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為是由于射線導(dǎo)致了耳蝸毛細(xì)胞、螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及血管紋的損傷[9～11]，60Coγ射線照射后超微結(jié)構(gòu)顯示內(nèi)外毛細(xì)胞排列紊亂、缺失，螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞萎縮或消失，發(fā)生細(xì)胞凋亡，血管紋萎縮。目前對(duì)于放療后感音神經(jīng)性聽力損失的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究多局限在內(nèi)耳方面，對(duì)于射線是否引起腦干耳蝸核的損傷目前尚未見報(bào)導(dǎo)。研究[ 12]認(rèn)為豚鼠ABR各波均有一個(gè)主要發(fā)生源,即波Ⅰ為第Ⅷ神經(jīng)，波Ⅱ?yàn)槎伜耍á鬄樯祥蠙旌?，波Ⅳ為外?cè)丘系。本研究中發(fā)現(xiàn)60Coγ射線照射后4、7、14、30 d豚鼠的ABR 反應(yīng)閾升高,波I、II、III潛伏期及I-II、II-III、I-III波間期延長(zhǎng)，因而，認(rèn)為波II潛伏期及II-III波間期延長(zhǎng)可能與60Coγ射線照射引起耳蝸核的損傷有關(guān)，隨著60Coγ射線照射后時(shí)間的延長(zhǎng)，ABR 反應(yīng)閾升高更明顯，波I、II、III波潛伏期及I-II、II-III、I-III波間期延長(zhǎng)更加明顯，提示聽力損害更加嚴(yán)重。

目前大多數(shù)研究者認(rèn)為神經(jīng)的損傷與細(xì)胞凋亡蛋白Caspase 3表達(dá)有關(guān)[13，14]，在正常細(xì)胞中Caspase 3以無(wú)活性的前體形式合成與儲(chǔ)存，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入凋亡過(guò)程中，激活Caspase 3，形成Caspase 3自我放大級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而裂解 DNA損傷細(xì)胞。Caspase 3是細(xì)胞凋亡中的關(guān)鍵蛋白酶，本研究發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組豚鼠耳蝸核在60Coγ射線照射后1、4、7 d神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目及染色改變不明顯，但照射后14天出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞腫脹,胞漿減少著色淺淡,胞核皺縮，尼氏體減少,膠質(zhì)細(xì)胞增生，數(shù)量增多，照射后30天上述改變更加明顯，Caspase 3表達(dá)明顯增強(qiáng)，提示60Coγ射線照射可導(dǎo)致耳蝸核神經(jīng)元的損傷，Caspase 3表達(dá)上調(diào)可能與耳蝸核細(xì)胞的損傷有關(guān)。另外，實(shí)驗(yàn)組豚鼠在60Coγ射線照射后14天耳蝸核神經(jīng)元才出現(xiàn)形態(tài)學(xué)改變，但耳蝸核神經(jīng)元Caspase 3在60Coγ射線照射后1天就開始呈現(xiàn)較強(qiáng)表達(dá)，而且照射后4天開始ABR反應(yīng)閾也升高，提示60Coγ射線照射后耳蝸核神經(jīng)元形態(tài)學(xué)改變可能遲于ABR及分子生物學(xué)的改變。60Coγ射線照射引起耳蝸核損傷可能與以下因素有關(guān)：①射線直接損傷耳蝸核神經(jīng)元；②耳蝸損傷繼發(fā)性引起耳蝸核神經(jīng)元的變性，即間接引起耳蝸核的損傷；③血管損傷導(dǎo)致耳蝸核神經(jīng)元缺血壞死。本研究的結(jié)果提示60Coγ射線照射不僅可引起耳蝸的病變[ 11]，也可能會(huì)導(dǎo)致腦干耳蝸核的病變，放射治療后導(dǎo)致感音神經(jīng)性聽力下降可能是多方面因素共同作用的結(jié)果。本研究?jī)H提示了60Coγ射線照射對(duì)耳蝸核形態(tài)結(jié)構(gòu)造成了損害,但還有許多問(wèn)題須進(jìn)一步的探討和完善,如延長(zhǎng)照射后觀察時(shí)間、耳蝸損傷與耳蝸核損傷的關(guān)系、使用Caspase 3抑制劑等是否可以保護(hù)射線對(duì)腦干耳蝸核的損傷均有待進(jìn)一步研究。

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