張先霞，王繁

（溫州醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325035，1.第二臨床醫(yī)學(xué)院；2附屬第二醫(yī)院 婦產(chǎn)科）

IVF-ET術(shù)后流產(chǎn)患者絨毛和蛻膜組織凋亡及相關(guān)調(diào)控蛋白的表達(dá)

張先霞1，王繁2

（溫州醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325035，1.第二臨床醫(yī)學(xué)院；2附屬第二醫(yī)院 婦產(chǎn)科）

目的：檢測(cè)體外受精-胚胎移植（IVF-ET）術(shù)后早期自然流產(chǎn)患者絨毛和蛻膜組織凋亡及相關(guān)調(diào)控蛋白血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、Bcl-2的表達(dá)，探討其發(fā)病和基因調(diào)控機(jī)制。方法：采用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測(cè)IVF-ET術(shù)后早期自然流產(chǎn)者（IVF-ET組）絨毛及蛻膜組織Bcl-2、VEGF的表達(dá)水平，并以同期正常早孕者（正常早孕組）的標(biāo)本為對(duì)照。結(jié)果：VEGF主要表達(dá)于絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿。IVF-ET組VEGF表達(dá)明顯低于正常早孕組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Bcl-2主要在絨毛合體滋養(yǎng)細(xì)胞上表達(dá)。IVF-ET組滋養(yǎng)細(xì)胞及蛻膜細(xì)胞染色較淺，表達(dá)呈弱陽性，正常早孕組染色較深，表達(dá)強(qiáng)陽性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜O.05）。結(jié)論：IVF-ET術(shù)后早期自然流產(chǎn)者絨毛及蛻膜組織中VEGF及Bcl-2表達(dá)顯著降低，提示早期妊娠中VEGF及Bcl-2的低表達(dá)可能是導(dǎo)致IVF-ET術(shù)后早期自然流產(chǎn)的原因之一。

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；Bcl-2；絨毛膜絨毛；蛻膜；體外受精-胚胎移植術(shù)；流產(chǎn)，自然

體外受精-胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET）作為人類輔助生殖中的重要技術(shù)，已成為不孕不育癥的理想治療措施之一。盡管IVF-ET技術(shù)水平逐漸提高，其分娩率目前仍只為22.8%～47.8%[1]，而自然妊娠后的分娩率為80%～90%[2]，因此對(duì)IVF-ET術(shù)后高流產(chǎn)率的研究具有重要的臨床意義。目前國(guó)內(nèi)有少量關(guān)于自然流產(chǎn)者絨毛及蛻膜組織中細(xì)胞周期和凋亡的研究報(bào)道，但I(xiàn)VF-ET術(shù)后自然流產(chǎn)患者絨毛及蛻膜組織中細(xì)胞凋亡及相關(guān)調(diào)控蛋白的表達(dá)情況國(guó)內(nèi)外鮮見報(bào)道。我們通過常規(guī)組織切片及免疫組織化學(xué)染色觀察IVF-ET術(shù)后自然流產(chǎn)及正常早孕者絨毛及蛻膜組織結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)變化，檢測(cè)和分析凋亡及相關(guān)調(diào)控蛋白血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial cell growth factor，VEGF）、Bcl-2的表達(dá)差異，探討IVF-ET術(shù)后自然流產(chǎn)的發(fā)病和基因調(diào)控機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

1.1.1 IVF-ET組：選取2010年6月至2011年9月在溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科實(shí)施IVF-ET助孕術(shù)后無明顯誘因出現(xiàn)自然流產(chǎn)的患者30例，年齡25～40歲，平均（28.92±3.23）歲，孕4～9周，平均（7.42±1.39）周。B超提示胚囊未見胚芽或未見原始心管搏動(dòng)而確認(rèn)為胚胎停育。流產(chǎn)后取絨毛及蛻膜組織。

1.1.2 正常早孕組： 選擇同期自愿實(shí)施人工流產(chǎn)術(shù)的女性30例，年齡20～35歲，平均（27.07±3.91）歲，孕4～10周，平均（7.17 4±1.23）周。B超證實(shí)為宮內(nèi)妊娠且符合孕周，可見胚芽及原始心管搏動(dòng)。流產(chǎn)術(shù)后取絨毛及蛻膜組織。

所有研究對(duì)象均身體健康，無自身免疫、內(nèi)分泌疾病，無生殖系統(tǒng)畸形、腫瘤和感染。月經(jīng)規(guī)律（月經(jīng)周期為28～30 d），3個(gè)月內(nèi)未服用甾體類藥物及抗早孕藥物，未放置宮內(nèi)節(jié)育器。同時(shí)男方精液正常，夫婦染色體核型正常。兩組間年齡、孕周以及以往流產(chǎn)次數(shù)進(jìn)行比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集與處理：高壓消毒并用焦碳酸二乙酯（DEPC）水處理收集標(biāo)本所需的器皿及工具，于吸宮術(shù)后找出絨毛及蛻膜組織各5 g（約 2.0 cm×2.0 cm大?。? ℃ 0.9%氯化鈉溶液洗凈。標(biāo)本置10%中性甲醛液中固定。送實(shí)驗(yàn)室取材石蠟包埋切片，常規(guī)染色病理組織學(xué)觀察。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色：鼠抗人VEGF單克隆抗體和鼠抗人Bcl-2單克隆抗體工作液購自福建邁新和北京中杉生物公司。采用免疫組織化學(xué)技術(shù)Envision二步法，實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒說明書進(jìn)行，最后經(jīng)DAB顯色，蘇木素復(fù)染。用已知陽性片作陽性對(duì)照，以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定 由2名病理科醫(yī)師獨(dú)立觀察切片中10個(gè)高倍視野（×400）。

Bcl-2陽性標(biāo)準(zhǔn)：Bcl-2定位于胞漿和胞膜內(nèi)，表達(dá)陽性信號(hào)為棕黃色。根據(jù)顯色程度分為4級(jí)：＜10%或無著色為（-）；10%～25%，淡黃色為（+）；25%～40%，棕黃色為（++）；＞40%，棕褐色為（+++）。

VEGF陽性標(biāo)準(zhǔn)：VEGF定位于胞漿，表達(dá)陽性信號(hào)為棕黃色。按陽性細(xì)胞占總細(xì)胞的百分比分為4級(jí)：＜5%為陰性（-）；5%～25%為陽性（+）；25%～50%為中度陽性（++）；＞50%為強(qiáng)陽性（+++）。陽性率統(tǒng)計(jì)以（++）及以上為標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 統(tǒng)計(jì)軟件采用SPSS11.0軟件包。率的比較用x2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病理組織學(xué)觀察 IVF-ET組：絨毛結(jié)構(gòu)完整，少數(shù)絨毛水腫，部分絨毛間質(zhì)輕度黏液變，部分見中央水池樣改變，合體滋養(yǎng)細(xì)胞及細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞增生不明顯；內(nèi)膜腺體部分見分泌反應(yīng)，腺體中度擴(kuò)張，細(xì)胞單層排列，立方形或低柱狀，未見明顯AS現(xiàn)象；蛻膜細(xì)胞發(fā)育不完全，細(xì)胞質(zhì)少，細(xì)胞平鋪但嵌合不良，部分細(xì)胞核不規(guī)則；間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較多，血管擴(kuò)張充血。

正常早孕組：絨毛結(jié)構(gòu)完整，少數(shù)絨毛水腫，間質(zhì)輕度黏液變，未見中央水池樣改變，合體滋養(yǎng)細(xì)胞及細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞明顯增生，以細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞為主；內(nèi)膜腺體擴(kuò)大彎曲，腺腔擴(kuò)張，內(nèi)有分泌物，腺上皮細(xì)胞透亮，胞質(zhì)豐富，呈簇狀突起，A-S反應(yīng)明顯；蛻膜細(xì)胞肥碩，細(xì)胞平鋪，胞質(zhì)豐富，相互嵌緊呈磚砌狀排列，核卵圓形，居中；間質(zhì)炎性細(xì)胞少量浸潤(rùn)，血管擴(kuò)張充血。

2.2 VEGF在絨毛及蛻膜組織中的表達(dá)與分布 VEGF主要表達(dá)于細(xì)胞胞漿中。在IVF-ET組：合體滋養(yǎng)細(xì)胞與部分細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞均可見表達(dá)，陽性率為67%；絨毛間質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)顯著，幾乎全部表達(dá)；蛻膜細(xì)胞部分表達(dá)，淺表層蛻膜細(xì)胞陽性較明顯，底層表達(dá)弱陽性。在正常早孕組：合體滋養(yǎng)細(xì)胞和細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞陽性表達(dá)率高，達(dá)90%，個(gè)別細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞未見表達(dá)，染色程度較IVF-ET組強(qiáng)；絨毛間質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞均見強(qiáng)陽性表達(dá)；蛻膜細(xì)胞全層表達(dá)，染色強(qiáng)度深淺不一；腺體也表達(dá)。見圖1-4。IVF-ET組與正常早孕組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜O.05），見表1。

圖1 VEGF在IVF-ET組絨毛中的表達(dá)（×200）

圖2 VEGF在正常早孕組絨毛中的表達(dá)（×200）

圖3 VEGF在IVF-ET組蛻膜中的表達(dá)（×200）

圖4 VEGF在正常早孕組蛻膜中的表達(dá)（×200）

表1 VEGF在兩組絨毛及蛻膜組織中的表達(dá)（n=30）

2.3 Bcl-2在絨毛與蛻膜組織中的表達(dá)與分布 Bcl-2主要在絨毛及蛻膜細(xì)胞胞漿及胞膜上表達(dá)。兩組均有明確表達(dá)。IVF-ET組：多表達(dá)在絨毛外圍合體滋養(yǎng)細(xì)胞，圍繞絨毛表達(dá)，細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞染色淺或不著色，表達(dá)弱陽性；蛻膜細(xì)胞表達(dá)弱陽性（見圖5-6）。正常早孕組：表達(dá)部位與IVF-ET組相同，但滋養(yǎng)細(xì)胞和蛻膜細(xì)胞染色深，表達(dá)強(qiáng)陽性（見圖7-8）。IVF-ET組與正常早孕組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜O.05），見表2。

圖5 Bcl-2在IVF-ET組絨毛中的表達(dá)（×200）

圖6 Bcl-2在IVF-ET組蛻膜中的表達(dá)（×200）

圖7 Bcl-2在正常早孕組絨毛中的表達(dá)（×200）

圖8 Bcl-2在正常早孕組蛻膜中的表達(dá)（×200）

表2 Bcl-2在兩組絨毛與蛻膜組織中的表達(dá)（n=30）

3 討論

3.1 絨毛及蛻膜細(xì)胞組織學(xué)改變 為更好地適應(yīng)胎兒的需要，胎盤通過蛻膜細(xì)胞及滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖與凋亡不斷進(jìn)行組織結(jié)構(gòu)的改建，以達(dá)到相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)維持妊娠。合體細(xì)胞的凋亡增加可能影響胎盤的功能，抑制血管的發(fā)生，引起供血不足。蛻膜提供胚胎發(fā)育以營(yíng)養(yǎng)支持， 來保護(hù)胚胎不受母親的免疫反應(yīng)并調(diào)整滋養(yǎng)層侵入子宮基質(zhì)的深度[3]。若這種平衡狀態(tài)被打破，將導(dǎo)致自然流產(chǎn)的發(fā)生。本研究比較了IVF-ET術(shù)后流產(chǎn)者與正常早孕者絨毛及蛻膜組織的病理組織學(xué)改變，發(fā)現(xiàn)兩組間絨毛及蛻膜細(xì)胞結(jié)構(gòu)及形態(tài)有明顯不同。在IVF-ET組中絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞增生不明顯，腺體小，分泌反應(yīng)低；蛻膜細(xì)胞發(fā)育不完全，細(xì)胞間嵌合不良。而正常早孕組，絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞增生明顯，腺體高度分泌反應(yīng)，A-S現(xiàn)象多見；蛻膜細(xì)胞肥碩，細(xì)胞嵌合緊密。提示IVFET術(shù)后流產(chǎn)者可能存在某些機(jī)制，導(dǎo)致絨毛及蛻膜細(xì)胞結(jié)構(gòu)及形態(tài)改變，細(xì)胞發(fā)育障礙，最終導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生。

3.2 VEGF在IVF-ET術(shù)后流產(chǎn)患者絨毛及蛻膜組織中表達(dá)下降的意義 VEGF和血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性受體結(jié)合，具有強(qiáng)大的促內(nèi)皮增殖、促血管生成作用。Hickey等[4]指出，血管生成對(duì)于人類子宮內(nèi)膜的增殖和分化、胚胎植入以及妊娠維持十分重要。VEGF在受精卵著床過程中發(fā)揮重要作用，并參與整個(gè)妊娠期間胎盤生長(zhǎng)過程的血管形成，妊娠婦女血中VEGF水平較非妊娠婦女有明顯的升高，且孕中期時(shí)達(dá)到高峰。因此血管的新生和血管化是構(gòu)建蛻膜毛細(xì)血管網(wǎng)以及胚胎生長(zhǎng)發(fā)育的基礎(chǔ)。VEGF單一等位基因的丟失或變異可導(dǎo)致胚胎在發(fā)育早期因血管異常而死亡[5]。Al-Khateeb等[6]研究173例早期習(xí)慣性流產(chǎn)患者發(fā)現(xiàn)，與正常早孕婦女相比，習(xí)慣性流產(chǎn)患者血清VEGF濃度明顯降低，說明VEGF表達(dá)下降使血管生成障礙，最終導(dǎo)致胚胎難以植入。Sherer等[7]和Kaloglu等[8]的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證明了這一點(diǎn)。

本研究通過檢測(cè)IVF-ET術(shù)后早期流產(chǎn)者和正常早孕者絨毛及蛻膜組織中VEGF的相對(duì)表達(dá)量的差異，探討VEGF表達(dá)情況與妊娠失敗的關(guān)系。結(jié)果顯示，VEGF在正常早孕者的蛻膜及絨毛組織中表達(dá)量相對(duì)較高，而在IVF-ET術(shù)后早期流產(chǎn)者的絨毛及蛻膜中表達(dá)量較低。這說明一定水平的VEGF的表達(dá)對(duì)妊娠的維持具有保護(hù)作用，而在妊娠早期滋養(yǎng)細(xì)胞向子宮肌層侵入的關(guān)鍵時(shí)期，VEGF表達(dá)下降可能導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞血管化不足，細(xì)胞過度凋亡而發(fā)生不可避免流產(chǎn)。因此，我們認(rèn)為在保胎治療中，先兆流產(chǎn)婦女補(bǔ)充外源性VEGF可能有利于維持妊娠，減少流產(chǎn)的發(fā)生。

3.3 Bcl-2與細(xì)胞凋亡 Bcl-2是Bcl-2基因家族中重要的細(xì)胞凋亡抑制基因，其功能主要是抑制細(xì)胞凋亡，延長(zhǎng)細(xì)胞壽命，而不影響細(xì)胞周期和分化。Bcl-2蛋白家族是調(diào)節(jié)凋亡的中心，對(duì)組織正常的生長(zhǎng)和細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡有著關(guān)鍵的作用[9]。對(duì)正常凋亡信號(hào)反應(yīng)的改變是癌癥的標(biāo)志，故以往對(duì)Bcl-2蛋白的研究多集中在癌癥方面。而妊娠早期，胚胎植入后，滋養(yǎng)層侵襲子宮內(nèi)膜，這個(gè)侵襲的過程類似腫瘤侵潤(rùn)性生長(zhǎng)的過程。我們研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2主要在早期絨毛合體滋養(yǎng)細(xì)胞及蛻膜細(xì)胞胞漿及胞膜上表達(dá)，而在細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)較低。分析原因可能為合體滋養(yǎng)細(xì)胞作為執(zhí)行功能的分化終末細(xì)胞，凋亡的發(fā)生是其必然結(jié)局，故其量較細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞高。在IVF-ET組絨毛染色淺或不著色，蛻膜細(xì)胞表達(dá)弱陽性，而正常早孕組合體滋養(yǎng)細(xì)胞和蛻膜細(xì)胞染色均較深，表達(dá)呈強(qiáng)陽性，IVF-ET組陽性率明顯低于正常早孕組，提示Bcl-2在抑制合體滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮重要作用，Bcl-2表達(dá)下降引起合體滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡增加，所致胎盤屏障通透性的增加可能在流產(chǎn)的發(fā)生中發(fā)揮了重要的作用。

綜上所述，VEGF表達(dá)異常，導(dǎo)致IVF-ET術(shù)后胎盤的血管發(fā)育不良供血不足，Bcl-2表達(dá)下降，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡失衡，影響滋養(yǎng)細(xì)胞分化、浸潤(rùn)，以上兩者最終影響胎兒和（或）胎盤的發(fā)育，導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生。至于兩者之間的相關(guān)性，有待進(jìn)一步研究。

[1] Malizia BA, Hacker MR, Penzias AS. Cumulative live-birth

rates after in vitro fertilization[J]. N Engl J Med, 2009, 360(3):236-243.

[2] 樂杰. 婦產(chǎn)科學(xué)[M]. 7版. 北京:人民衛(wèi)生出版社, 2008:83-86.

[3] Plaisier M, Dennert I, Rost E, et al. Decidual vascularization and the expression of angiogenic growth factors and proteases in first trimester spontaneous abortions[J]. Hum Reprod, 2009, 24(1):185-197.

[4] Hickey M, Fraser IS. The structure of endometrial microvessels[J]. Hum Reprod, 2000, 15(3):57-66.

[5] Kashida S, Sugino N, Takiguchi S, et al. Regulation and role of vascular endothelial growth factor in the corpus luteum during mid-pregnancy in rats[J]. Biol Reprod, 2001, 64(1):317-323.

[6] Al-Khateeb GM, Mustafa FE, Sater MS, et al. Effect of the functional VEGFA-583C/T variant on vascular endothelial growth factor levels and the risk of recurrent spontaneous miscarriage[J]. Fertil Steril, 2011, 95(8):2471-2473.

[7] Sherer DM, Abulafia O. Angiogenesis during implantation and placental and early embryonic development[J]. Placenta,2001, 22(1):1-13.

[8] Kaloglu C, Bulut HE. Vascular endothelial growth factor production by rat granulated metrial gland cells and their morphological features in normal and pathological conditions[J]. Reprod Fertil Dev, 2007, 19(2):341-350.

[9] Bajwa N, Liao C, Nikolovska-Coleska Z. Inhibitors of the anti-apoptotic Bcl-2 proteins:a patent review[J]. Expert Opin Ther Pat, 2012, 22(1):37-55.

Human chorionic villi and deciduas apoptosis and related modulin expression of IVF-ET failure

ZHANG Xianxia*，WANG Fan.*The Second Clinical Medical Institute of Wenzhou Medical College，Wenzhou，325035

Objective:To investigate the human chorionic villi and deciduas apoptosis and related regulatory protein(VEGF，Bcl-2)expression in early spontaneous abortion after treatment of in vitro fertilization-embryo transfer(IVF-ET)and explore the pathomechanism of spontaneous abortion.Methods:The expression of VEGF and Bcl-2 in the chorionic villi and deciduas was detected and analyzed in 30 cases of early spontaneous abortion patients after in vitro fertilization-embryo transfer(IVF-ET)through immunohistochemisty method，Thirty cases of normal early pregnancy as control.Results:Immunohistochemistry displayed that VEGF mainly expressed in cytoplasm of villi trophocyte and vascular endothelial cell. The VEGF level of early spontaneous abortion after IVF-ET group was significantly lower than that of normal early pregnancy group(P＜0.05). Bcl-2 mainly expressed in the villi syncytiotrophoblast.Trophoblasts and decidual staining were shallow and weakly positive in early spontaneous abortion after IVF-ET group. But trophoblasts and decidual of normal early pregnancy group were deeply stained，the expression was strong positive. Difference between two groups was significant(P＜0.05).Conclusion:The expression of VEGF and Bcl-2 decreases significantly in both chorionic villi and deciduas of early spontaneous abortion after IVF-ET. We speculate that the reduction of the expression of VEGF and Bcl-2 in the deciduas and chorionic villi in early gestation stage may cause abortion.

VEGF；Bcl-2；chorionic villi；deciduas；IVF-ET；abortion，spontaneous

R71

A

1000-2138（2012）06-0545-04

2012-05-15

浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動(dòng)計(jì)劃（新苗人才計(jì)劃）項(xiàng)目（2010R413028）。

張先霞（1988-），女，浙江新昌人，本科生。

王繁，副主任醫(yī)師，Email：wangfan7510@sohu.com。

丁敏嬌）

·論 著·