亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        一種斑馬魚(yú)肝臟特異表達(dá)轉(zhuǎn)基因載體的制備方法

        2012-01-13 01:12:08陳將飛陳元紅靳大慶
        關(guān)鍵詞:斑馬魚(yú)轉(zhuǎn)基因克隆

        陳將飛,陳元紅,靳大慶

        (1.浙江省模式生物技術(shù)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,溫州醫(yī)學(xué)院水域科學(xué)與環(huán)境生態(tài)研究所,浙江 溫州325035;2.國(guó)家遺傳工程實(shí)驗(yàn)室,復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)院 上海 200433)

        一種斑馬魚(yú)肝臟特異表達(dá)轉(zhuǎn)基因載體的制備方法

        陳將飛1,陳元紅1,靳大慶2

        (1.浙江省模式生物技術(shù)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,溫州醫(yī)學(xué)院水域科學(xué)與環(huán)境生態(tài)研究所,浙江 溫州325035;2.國(guó)家遺傳工程實(shí)驗(yàn)室,復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)院 上海 200433)

        目的:建立一套快速制備斑馬魚(yú)肝臟特異表達(dá)轉(zhuǎn)基因載體的新方法。方法:首先利用multi-site gateway技術(shù)將斑馬魚(yú)肝臟脂肪酸結(jié)合蛋白(fabp10a)啟動(dòng)子片段與入門(mén)載體進(jìn)行BP重組獲得啟動(dòng)子的入門(mén)克隆pENTR-fabp10a,然后將目的基因克隆到載體pME-MCS中形成入門(mén)克隆pENTR-interest,最后通過(guò)multi-site gateway技術(shù)將pENTR-fabp10a、pENTR-interest和含有EGFP標(biāo)記基因的p3E-IRES-EGFPpA質(zhì)粒在Tol2轉(zhuǎn)座載體pDestTol2pA2上進(jìn)行定向重組即可獲得斑馬魚(yú)肝臟特異性表達(dá)轉(zhuǎn)基因載體pTol2-fabp10a-interest-IRES-EGFP。本研究采用紅色熒光蛋白基因DsRed2作為目的基因,用上述方法構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因載體pTol2-fabp10a-DsRed2-IRES-EGFP,并將其注射至單細(xì)胞期斑馬魚(yú)胚胎中進(jìn)行表達(dá)分析。結(jié)果:轉(zhuǎn)基因載體pTol2-fabp10a-DsRed2-IRES-EGFP在斑馬魚(yú)肝臟組織中能實(shí)現(xiàn)紅色和綠色熒光蛋白同步特異表達(dá)。結(jié)論:利用Tol2轉(zhuǎn)座系統(tǒng)以及multi-site gateway技術(shù)構(gòu)建斑馬魚(yú)肝臟特異性表達(dá)轉(zhuǎn)基因載體是一套行之有效的方法。

        Tol2轉(zhuǎn)座子;斑馬魚(yú);multi-site gateway技術(shù);肝臟特異性表達(dá)

        轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建是開(kāi)展基因功能和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型構(gòu)建研究的基礎(chǔ)。傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建方法主要是通過(guò)分子克隆手段將組織特異性啟動(dòng)子、目的基因連入到真核表達(dá)載體中來(lái)實(shí)現(xiàn)的,為了便于觀察目的基因的表達(dá),往往還會(huì)在目的基因的末端融合表達(dá)報(bào)告基因。該方法盡管能實(shí)現(xiàn)目的基因在動(dòng)物組織中的特異表達(dá),但存在以下幾個(gè)缺點(diǎn):首先,轉(zhuǎn)基因效率較低,不利于得到穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因品系;其次,在特異啟動(dòng)子下表達(dá)的兩個(gè)融合蛋白,目的蛋白的生物活性可能受到影響;最后,還常需考慮融合蛋白中后一種蛋白的移碼突變。為了克服傳統(tǒng)方法中的不足,本研究擬以斑馬魚(yú)肝臟作為靶器官,根據(jù)脂肪酸結(jié)合蛋白只在斑馬魚(yú)肝臟組織中表達(dá)的特性,并結(jié)合Tol2轉(zhuǎn)座子能夠?qū)崿F(xiàn)目的基因在基因組中高效整合的特點(diǎn),通過(guò)multi-site gateway技術(shù)建立一套快速制備斑馬魚(yú)肝臟特異性表達(dá)轉(zhuǎn)基因載體的方法并在斑馬魚(yú)中驗(yàn)證其表達(dá)。

        1 材料和方法

        1.1 斑馬魚(yú)的養(yǎng)殖 斑馬魚(yú)(Danio rerio)為野生型AB品系,引自美國(guó)Oregon州立大學(xué),喂養(yǎng)方案按照Z(yǔ)ebrafish Book描述進(jìn)行[1]。按照Kimmel等[2]描述對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育階段進(jìn)行分期。受精卵由清晨雌雄魚(yú)交配獲得,然后將受精卵放于孵化液(60 mg/mL海鹽)中,28.5 ℃孵化。每天更換孵化液。96 h后開(kāi)始投放人工飼料(Argent Laboratories)。超過(guò)24 h的胚胎經(jīng)0.003%苯硫脲(PTU)處理以防止黑色素的形成。

        1.2 multi-site gateway技術(shù)工作原理 利用Invitrogen公司的multi-site gateway技術(shù)構(gòu)建表達(dá)載體,其原理是首先通過(guò)PCR從基因組中獲得目的基因,目的基因兩側(cè)含有PCR反應(yīng)引入的attB序列,該序列可以在BP克隆酶的作用下與入門(mén)載體上的attP序列進(jìn)行BP重組反應(yīng)獲得入門(mén)克?。ㄒ?jiàn)圖1),入門(mén)克隆除了原有載體上的CCDB 基因被目的基因置換以外,其attP序列也由于部分置換而形成了新的attL序列。入門(mén)克隆可以在LR克隆酶的作用下與目的載體上的attR序列進(jìn)行LR重組反應(yīng)進(jìn)而獲得所需的表達(dá)克?。ㄒ?jiàn)圖1)。

        圖1 multi-site gateway技術(shù)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體流程圖

        1.3 Tol2轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)工作原理 將載體pCS2FA-transposase進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生transposase mRNA,然后將transposase mRNA與轉(zhuǎn)基因載體共注射至單細(xì)胞期的斑馬魚(yú)胚胎中。Transposase mRNA進(jìn)入到細(xì)胞后,利用細(xì)胞內(nèi)的翻譯組件合成進(jìn)行轉(zhuǎn)座反應(yīng)的轉(zhuǎn)座酶。轉(zhuǎn)座酶會(huì)識(shí)別轉(zhuǎn)基因載體上的Tol2序列,然后將其攜帶的作用元件整合到斑馬魚(yú)基因組中(見(jiàn)圖2),從而實(shí)現(xiàn)外源基因在種系之間的穩(wěn)定遺傳,具體原理可參考文獻(xiàn)[3]。

        圖2 Tol2轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)斑馬魚(yú)胚胎工作原理

        1.4 pENTR-fabp10a載體的構(gòu)建 根據(jù)Gene-Bank上已報(bào)道的斑馬魚(yú)fabp10a基因上游調(diào)控序列(GenBank GI:ID 23308626)設(shè)計(jì)引物,F(xiàn):5’-ctgga caatatattattagcccc-3’;R:5’-ttcagatctgcagcttt tatatcg-3’。其中上游引物引入multi-site gateway技術(shù)所需要的序列g(shù)gggacaactttgtatagaaaagt tg(attB4),下游引物引入ggggactgcttttttgtaca aacttg(attB1)。引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。PCR反應(yīng)以斑馬魚(yú)基因組DNA為模板,使用寶生物公司生產(chǎn)的TaKaRa LA Taq聚合酶擴(kuò)增長(zhǎng)度為2885 bp的fabp10a啟動(dòng)子序列,PCR條件如下:94 ℃預(yù)變性5 min,每循環(huán)包括94 ℃變性1 min,62 ℃復(fù)性1 min,72 ℃延伸3 min,共30個(gè)循環(huán),最后1個(gè)循環(huán)結(jié)束后再72 ℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,并進(jìn)行測(cè)序核實(shí)。擴(kuò)增產(chǎn)物與入門(mén)載體pDONR-P4-P1R(Invetrogen公司)進(jìn)行BP重組反應(yīng),生成入門(mén)克隆pENTR-fabp10a。

        1.5 pENTR-DsRed2載體的構(gòu)建 利用BamHI和NotI限制性內(nèi)切酶雙酶切pDsRed2(Clontech公司)質(zhì)粒,膠回收DsRed2基因片段,然后將DsRed2基因片段亞克隆到經(jīng)相同限制性內(nèi)切酶消化的載體pME-MCS(美國(guó)Utah大學(xué)醫(yī)學(xué)中心Chien教授惠贈(zèng))上,表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)(MCS)上含有KpnI、XhoI、SalI、Bsp106、HindIII、EcoRI、PstI、SmaI、BamHI、SpeI、XbaI、NotI、XmaIII、SacII、BstXI和SacI等16個(gè)酶切位點(diǎn),因此能夠被限制性內(nèi)切酶BamHI和NotI切開(kāi),酶切產(chǎn)物經(jīng)T4連接酶連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α,所獲重組克隆經(jīng)酶切、測(cè)序鑒定獲得pENTR-DsRed2質(zhì)粒。

        1.6 pTol2-fabp10a-DsRed2-IRES-EGFP表達(dá)載體的構(gòu)建 將構(gòu)建好的 pENTR-fabp10a、pENTR-DsRed2和含有EGFP標(biāo)記基因的p3E-IRES-EGFPpA質(zhì)粒(美國(guó)Utah大學(xué)醫(yī)學(xué)中心Chien教授惠贈(zèng))在Tol2轉(zhuǎn)座載體pDestTol2pA2上(美國(guó)Utah大學(xué)醫(yī)學(xué)中心Chien教授惠贈(zèng))進(jìn)行LR重組(見(jiàn)圖3),獲得重組質(zhì)粒pTol2-fabp10a-DsRed2-IRES-EGFP。重組質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序和轉(zhuǎn)基因表達(dá)鑒定獲得陽(yáng)性克隆pTol2-fabp10a-DsRed2-IRES-EGFP。

        圖3 multi-site gateway技術(shù)構(gòu)建重組質(zhì)粒pTol2-fabp10a-DsRed2-IRESEGFP流程圖

        1.7 斑馬魚(yú)肝臟特異表達(dá)轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體的表達(dá)分析 ① 轉(zhuǎn)座酶基因的體外轉(zhuǎn)錄:用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒Message Machine TM SP6 Kit(Ambion,TX,USA)將含有轉(zhuǎn)座酶基因的pCS-TP質(zhì)粒(Kawakami實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng))進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA用酚氯仿抽提,無(wú)水乙醇沉淀后溶于DEPC水中,并稀釋成200 μg/mL的終濃度保存在-80 ℃。② 斑馬魚(yú)胚胎收集:顯微注射前一天下午在投喂豐年蟲(chóng)完30 min后,從孵化箱內(nèi)撈取雌、雄各四條斑馬魚(yú)分別放入tank(交配缸)的隔板兩側(cè),隔離過(guò)夜。注射當(dāng)天開(kāi)燈后,實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備就緒后將交配缸中的隔板拉開(kāi)。10 min后開(kāi)始收集胚胎,分選和清洗胚胎到有瓊脂糖的表面皿中。注射外源DNA的濃度為30 ng/μL,DNA體積約2 nL。受精卵的動(dòng)物極注射完畢后,慢慢抽出注射針,將受精卵放入加有抗生素的干凈胚胎培養(yǎng)液中,使其恢復(fù)發(fā)育,光照培養(yǎng)箱28 ℃培養(yǎng),分別在24、48和72 h后熒光顯微鏡下觀察篩選肝臟組織具有熒光蛋白的個(gè)體,有綠色熒光蛋白的個(gè)體表示成功載入目的基因的嵌合個(gè)體。

        2 結(jié)果

        2.1 fabp10a啟動(dòng)子的PCR擴(kuò)增以及pENTR-fabp10a克隆的構(gòu)建 以斑馬魚(yú)基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,其產(chǎn)物以1%的瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳分析,可見(jiàn)約2.8 kb的特異條帶(見(jiàn)圖4)。將擴(kuò)增產(chǎn)物與pDONR P4-P1R 進(jìn)行BP重組,由于pDONR P4-P1R上含有CCDB基因,CCDB基因能表達(dá)相應(yīng)蛋白,該蛋白會(huì)破壞細(xì)菌的DNA gyrase,造成細(xì)菌染色體的降解從而導(dǎo)致細(xì)菌死亡,因此,重組后陽(yáng)性克隆中的fabp10a啟動(dòng)子能夠替換pDONR P4-P1R中的CCDB基因而在培養(yǎng)基上長(zhǎng)出菌落,沒(méi)有重組的陰性產(chǎn)物由于含有CCDB基因而不能長(zhǎng)出菌落。由于利用重組技術(shù)制備的DNA沒(méi)有限制性內(nèi)切酶位點(diǎn),重組DNA經(jīng)測(cè)序證實(shí)pENTR-fabp10a克隆構(gòu)建成功。

        圖4 PCR擴(kuò)增Fabp10a 啟動(dòng)子片段

        2.2 pENTR-DsRed2載體的構(gòu)建 pDsRed2載體經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHI和NotI雙酶切,酶切產(chǎn)物純化后與經(jīng)相同限制性內(nèi)切酶消化后的載體pME-MCS進(jìn)行連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α,挑選含有pENTR-DsRed2重組質(zhì)粒的陽(yáng)性克隆,提取質(zhì)粒后,利用限制性內(nèi)切酶BamHI和NotI進(jìn)行雙酶切,酶切產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,電泳產(chǎn)生兩條帶,大小分別為2765和708 bp(見(jiàn)圖5),這與預(yù)期結(jié)果相符,說(shuō)明pENTR-DsRed2重組質(zhì)??寺〕晒?,該結(jié)果得到了進(jìn)一步的測(cè)序證實(shí)。

        2.3 pTol2-fabp10a-DsRed2-IRES-EGFP表達(dá)載體的構(gòu)建 將構(gòu)建好的pENTR-fabp10a入門(mén)克隆與已構(gòu)建的pENTR-DsRed2以及p3E-IRES-EGFP pA和pDestTol2pA2質(zhì)粒按照Invitrogen公司的multi-site gateway技術(shù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行LR重組反應(yīng),重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)菌,挑選含有pTol2-fabp10a-DsRed2-IRESEGFP表達(dá)載體的克隆。由于利用重組技術(shù)制備的DNA沒(méi)有限制性內(nèi)切酶位點(diǎn),所以提取質(zhì)粒后直接測(cè)序確定,并在下一步通過(guò)斑馬魚(yú)單細(xì)胞胚胎顯微注射表達(dá)載體的方法進(jìn)一步證實(shí)pTol2-fabp10a-DsR ed2-IRES-EGFP構(gòu)建成功。

        圖5 pENTR-DsRed2酶切鑒定圖

        2.4 斑馬魚(yú)肝臟特異表達(dá)轉(zhuǎn)基因載體的表達(dá)分析

        將純化好的表達(dá)載體pTol2-fabp10a-DsRed2-IRES-EGFP和體外轉(zhuǎn)錄得到的轉(zhuǎn)座酶mRNA以等比例(濃度分別為25 ng/μL)注射到單細(xì)胞期的斑馬魚(yú)胚胎中,在轉(zhuǎn)座酶的作用下,pTol2-fabp10a-DsRed2-IRES-EGFP會(huì)整合到斑馬魚(yú)基因組中。在胚胎發(fā)育至72 h后,熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)顯微注射了pTol2-fabp10a-DsRed2-IRES-EGFP表達(dá)質(zhì)粒的斑馬魚(yú)胚胎肝臟組織既有紅色熒光蛋白也有綠色熒光蛋白的特異表達(dá),且綠色熒光蛋白表達(dá)的時(shí)空模式與紅色熒光蛋白相同(見(jiàn)圖6)。這說(shuō)明我們用于構(gòu)建斑馬魚(yú)肝臟特異性表達(dá)轉(zhuǎn)基因載體的方法是可行的。

        圖6 紅色熒光蛋白和綠色熒光蛋白在斑馬魚(yú)肝臟組織中的特異表達(dá)

        3 討論

        長(zhǎng)期以來(lái),在脊椎動(dòng)物的轉(zhuǎn)基因模型構(gòu)建過(guò)程中無(wú)可避免的會(huì)碰到三大技術(shù)難題[4],首先傳統(tǒng)的分子克隆構(gòu)建過(guò)程費(fèi)時(shí)、費(fèi)力;其次,轉(zhuǎn)基因載體上缺乏標(biāo)記基因,給多世代的篩選帶來(lái)了不便;第三,轉(zhuǎn)基因載體無(wú)法實(shí)現(xiàn)在基因組上的高效整合和子代個(gè)體中的高頻表達(dá)。以往采用傳統(tǒng)方法構(gòu)建斑馬魚(yú)肝臟特異表達(dá)目的基因的轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體,首先需要在待表達(dá)目的基因上游引入肝臟特異性啟動(dòng)子來(lái)驅(qū)動(dòng)目的基因的表達(dá);其次,為了實(shí)現(xiàn)可視化檢測(cè)目的基因表達(dá)與否,還需在目的基因下游引入報(bào)告基因(如GFP或RFP);最后,為了克服目的基因和報(bào)告基因形成的融合蛋白可能對(duì)目的基因功能的影響,還需要引入內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES),以保證其能夠翻譯一條mRNA上的兩個(gè)開(kāi)放性閱讀框,實(shí)現(xiàn)目的基因和報(bào)告基因的同步表達(dá)[5-7]。上述表達(dá)載體的構(gòu)建需要把多個(gè)元件通過(guò)限制性內(nèi)切酶和連接酶整合到一起,工作不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力,還可能因?yàn)橄拗菩詢?nèi)切酶位點(diǎn)受限而不能實(shí)現(xiàn)。此外,以傳統(tǒng)方法構(gòu)建的表達(dá)載體由于片段太大,很難采用胚胎顯微注射線性化表達(dá)載體的方法使目的基因高效地整合到斑馬魚(yú)基因組中。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)傳統(tǒng)方法可能遇到的上述難題,把multi-site gateway技術(shù)和Tol2轉(zhuǎn)基因技術(shù)結(jié)合起來(lái),建立了快速、方便、基因組整合效率高的轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體構(gòu)建方法。

        本實(shí)驗(yàn)所采用的gateway技術(shù)是把肝臟特異性基因Fabp10a啟動(dòng)子序列、待表達(dá)的目的基因(本實(shí)驗(yàn)為紅色熒光蛋白)及報(bào)告基因(綠色熒光蛋白)按照一定的順序整合到Tol2轉(zhuǎn)座系統(tǒng),這大大簡(jiǎn)化了基因克隆和亞克隆的步驟,同時(shí)具有較高的克隆效率,并可以保證正確的方向和閱讀框。重要的是gateway技術(shù)利用了位點(diǎn)特異重組,所以在構(gòu)建入門(mén)載體后,不再需要使用限制性內(nèi)切酶和連接酶,就能把不同的入門(mén)載體整合到經(jīng)gateway技術(shù)改造過(guò)的表達(dá)載體pDestTol2pA2中。pDestTol2pA2是以Tol2轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)為基礎(chǔ),因?yàn)門(mén)ol2轉(zhuǎn)基因技術(shù)具有可攜帶大片段外源DNA、單拷貝整合效率高、轉(zhuǎn)座子活性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),使得以Tol2轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)為載體的轉(zhuǎn)基因技術(shù)在多種生物中得到應(yīng)用。斑馬魚(yú)中利用傳統(tǒng)的顯微注射超螺旋或線性化質(zhì)粒到單細(xì)胞胚胎中的轉(zhuǎn)基因技術(shù)效率低,僅能獲得1%~10%的種系傳代親本[8-9]。而利用Tol2轉(zhuǎn)座載體,可將這一效率提升至50%,同時(shí)可攜帶長(zhǎng)達(dá)11 kb的外源性標(biāo)記基因整合到受體基因組的染色體上[10]。

        本實(shí)驗(yàn)以紅色熒光蛋白基因DsRed2作為目的基因,構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因表達(dá)質(zhì)粒pTol2-fabp10a-DsRed2-IRES-EGFP,同時(shí)將pME-MCS與其他質(zhì)粒進(jìn)行定向重組,構(gòu)建了pTol2-fabp10a-MCS-IRES-EGFP表達(dá)質(zhì)粒,將這兩組質(zhì)粒分別顯微注射到單細(xì)胞期的斑馬魚(yú)胚胎中,72 h后熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)表達(dá)質(zhì)粒pTol2-fabp10a-MCS-IRES-EGFP在斑馬魚(yú)肝臟組織中有綠色熒光蛋白特異表達(dá)(數(shù)據(jù)未顯示),pTol2-fabp10a-DsRed2-IRES-EGFP則在斑馬魚(yú)肝臟中既有紅色熒光蛋白的表達(dá)也有綠色熒光蛋白表達(dá)(見(jiàn)圖6),這說(shuō)明我們用于構(gòu)建斑馬魚(yú)肝臟特異表達(dá)轉(zhuǎn)基因載體的方法是可行的。

        本研究通過(guò)multi-site gateway技術(shù)和Tol2轉(zhuǎn)基因技術(shù)建立的制備斑馬魚(yú)肝臟特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)基因載體的方法可以實(shí)現(xiàn)肝臟發(fā)育候選基因在基因組上的高效整合,另外通過(guò)熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)情況,就可以準(zhǔn)確判定目的基因的時(shí)空表達(dá)。因此,利用該方法構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因載體對(duì)于肝臟發(fā)育候選基因的轉(zhuǎn)基因模型構(gòu)建以及相關(guān)基因功能方面的研究具有重大的意義。另外,此構(gòu)建思路對(duì)于其他臟器的轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體的構(gòu)建也具有一定的參考價(jià)值。

        [1] Westerfield M. The Zebrafish Book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)[M].3rd Edition. Eugene,OR,USA:University of Oregon Press, 1995.

        [2] Kimmel CB, Ballard WW, Kimmel SR, et al. Stages of embryonic development of the zebrafish[J]. Dev Dyn, 1995,203(3):253-310.

        [3] Kawakami K.Tol2:a versatile gene transfer vector in vertebrates[J]. Genome Biol, 2007, 8 (Suppl 1):S7.

        [4] Kwan KM, Fujimoto E, Grabher C, et al. The Tol2 kit:A multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs[J]. Dev Dyn, 2007, 236(11):3088-3099.

        [5] Sasaki Y, Sone T, Yahata K, et al. Multi-gene gateway clone design for expression of multiple heterologous genes in living cells: Eukaryotic clones containing two and three ORF multi-gene cassettes expressed from a single promoter[J]. J Biotechnol,2008,136(3-4):103-112.

        [6] Ito T, Tahara SM, Lai MM. The 3’-untranslated region of hepatitis C virus RNA enhances translation from an internal ribosomal entry site[J]. J Virology,1998,72(11):8789-8796.

        [7] 陳婷芳, 羅娜, 謝華平, 等. 利用Tol2轉(zhuǎn)座子構(gòu)建斑馬魚(yú)心臟組織特異表達(dá)轉(zhuǎn)基因載體及其表達(dá)分析[J]. 生物工程學(xué)報(bào),2010,26(2):230-236.

        [8] Stuart GW, McMurray JV, Westerfield M. Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos [J]. Development,1988,103(2):403-412.

        [9] Stuart GW, Vielkind JR, McMurray JV, et al. Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression[J].Development,1990,109(3):577-584.

        [10]Urasaki A, Morvan G, Kawakami K. Functional dissection of the Tol2 transposable element identified the minimal cissequence and a highly repetitive sequence in the subterminal region essential for transposition[J]. Genetics,2006,174(2):639-649.

        One method for preparing zebrafish liver-specific expression transgenic vectors

        CHEN Jiangfei*,CHEN Yuanhong,JIN Daqing.
        *Zhejiang Provincial Key Laboratory for Technology and Application of Model Organisms,Institute of Watershed Science and Environmental Ecology,Wenzhou Medical College,Wenzhou,325035

        Objective:To establish a simple and efficient method for preparing zebrafish liver specific expression vector.Methods:The promoter of fatty acid-binding protein(FABP10a), specifically expressed in liver of zebrafish, was firstly cloned into the vector by multi-site gateway BP recombination reaction to generate a entry clone pEnter-fabp10a. Then the interest gene was inserted into pME-MCS to generate another entry clone pENTR-interest.Finally, the transgenic vector pTol2-fabp10a-interest-IRES-EGFP were prepared through LR recombination reaction between pENTR-fabp10a Entry and plasmids(pENTR-interest、p3E-IRESEGFPpA and pDestTol2pA2)using the multi-site gateway technique. To test the effectiveness of this method,repoter gene dsRed2 was used as a target gene. The constructed gene vector pTol2-fabp10a-DsRed2-IRES-EGFP was microinjected to single cell stage zebrafish embryos for expression analysis.Results:The transgenic vector pTol2-fabp10a-DsRed2-IRES-EGFP achieved the red and green fluorescent protein specific expression in zebrafish liver tissue.Conclusion:It is an effective method using Tol2 transposable element and multi-site gateway technology to construct the zebrafish liver specific expression vectors.

        Tol2 transposon;zebrafish;multi-site gateway technology;liver-specific expression

        Q812

        A

        1000-2138(2012)05-0453-05

        2012-05-04

        浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目(2010R413049)。

        陳將飛(1984-),女,河南洛陽(yáng)人,助理實(shí)驗(yàn)師,理學(xué)碩士。

        吳健敏)

        ·護(hù)理研究·

        猜你喜歡
        斑馬魚(yú)轉(zhuǎn)基因克隆
        斑馬魚(yú)天生就能辨別數(shù)量
        探秘轉(zhuǎn)基因
        克隆狼
        轉(zhuǎn)基因,你吃了嗎?
        小斑馬魚(yú)歷險(xiǎn)記
        浙江:誕生首批體細(xì)胞克隆豬
        瓜蔞不同部位對(duì)斑馬魚(yú)促血管生成及心臟保護(hù)作用
        中成藥(2017年6期)2017-06-13 07:30:35
        抗BP5-KLH多克隆抗體的制備及鑒定
        天然的轉(zhuǎn)基因天然的轉(zhuǎn)基因“工程師”及其對(duì)轉(zhuǎn)基因食品的意蘊(yùn)
        Galectin-7多克隆抗體的制備與鑒定
        中文字幕av一区二区三区人妻少妇| 亚洲美女主播一区二区| 国产三级韩三级日产三级| 亚洲黄色天堂网站在线观看禁18| 黑人巨大精品欧美一区二区| 欧美日韩另类视频| 日韩精品一区二区三区四区五区六| 国产中文字幕亚洲精品| 成人中文乱幕日产无线码| 欧美熟妇色ⅹxxx欧美妇| 国内精品福利在线视频| 精品久久综合亚洲伊人| 杨幂Av一区二区三区| 国产丝袜爆操在线观看| 男人边做边吃奶头视频| 日韩精品无码久久一区二区三| 亚洲日日噜噜噜夜夜爽爽| 亚洲伊人久久大香线蕉| 亚洲国产精品久久电影欧美| 内射交换多p国产| 国产女主播强伦视频网站| 免费国产一区二区视频| 久久久久亚洲精品无码蜜桃| 亚洲av日韩精品久久久久久| 99久久无色码中文字幕鲁信| 精品粉嫩av一区二区三区| 中文字幕丰满乱子无码视频| 亚洲a∨天堂男人无码| 亚洲一级天堂作爱av| 久久综合久久美利坚合众国| 人与禽交av在线播放| 国产亚洲欧美另类久久久| 日本老熟妇五十路一区二区三区| 综合色就爱涩涩涩综合婷婷| 国产激情з∠视频一区二区| 国产一区二区三区杨幂| 亚洲国产精品情侣视频| 国产亚洲2021成人乱码| 亚洲区在线播放| 亚洲国产大胸一区二区三区| 亚洲精品无码永久中文字幕|