白鳳翎，張柏林，趙宏飛

1(渤海大學(xué)化學(xué)化工與食品安全學(xué)院，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧錦州，121013)2(北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京，100083)

酸奶是由保加利亞乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii bulgaricus)和嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)混合發(fā)酵牛奶形成的發(fā)酵乳制品，目前用于酸奶生產(chǎn)的發(fā)酵劑主要為直投式發(fā)酵劑(Directed Vat Set，DVS)，其中乳酸菌的細(xì)胞數(shù)量是決定發(fā)酵劑性能的關(guān)鍵因素。由于乳酸菌缺乏一些生物代謝途徑，不能合成生長(zhǎng)必需的氨基酸、維生素等物質(zhì)，營(yíng)養(yǎng)要求十分苛刻。同時(shí)，乳酸菌具有很弱的蛋白分解能力，必需依賴生長(zhǎng)環(huán)境提供必需氨基酸、維生素等生長(zhǎng)因子才能獲得高密度細(xì)胞培養(yǎng)。本研究根據(jù)van Niel等［1］關(guān)于乳酸菌的營(yíng)養(yǎng)需要，并參考Zhang等的研究結(jié)果［2］，設(shè)計(jì)嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌生長(zhǎng)的化學(xué)限定培養(yǎng)基(Chemically Defined Media，CDM)，以小于5 ku分子量的大豆蛋白水解物(soy protein hydrolysates，SPH)作為氮源生長(zhǎng)添加物促進(jìn)乳酸菌細(xì)胞增殖，從生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)、產(chǎn)酸能力等分析SPH中多肽、氨基酸對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的促進(jìn)作用機(jī)制，為生產(chǎn)高密度乳酸菌直投式發(fā)酵劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種

嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)S1菌株，德式乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckii bulgaricus)L2菌株，北京林業(yè)大學(xué)食品發(fā)酵實(shí)驗(yàn)室保存菌種。冷凍干燥的供試菌株首先接種11%的脫脂乳培養(yǎng)基，在MRS瓊脂上劃線分離，37℃培養(yǎng)24～48 h。每次試驗(yàn)取單菌落經(jīng)MRS液體培養(yǎng)基中活化3次，以充分恢復(fù)菌株活力。

1.2 大豆蛋白水解物制備

大豆蛋白水解物以大豆分離蛋白為基質(zhì)，按5%底物濃度90℃水浴中預(yù)熱15 min，冷卻，調(diào)節(jié)pH值至pH 8.0。按4 000 U/g加入堿性蛋白酶，50℃水浴作用6 h。在反應(yīng)過(guò)程中，滴加2.0 mol/L NaOH維持pH值穩(wěn)定。反應(yīng)結(jié)束后在85℃下加熱10 min鈍化酶，離心取上清液。經(jīng)Millipore Labscale TFF System Kit超濾獲得小于5 ku分子質(zhì)量的大豆蛋白水解物，經(jīng)測(cè)定其中多肽和氨基酸含量為3.02 g/100 mL。

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 保加利亞乳桿菌培養(yǎng)基

1.3.1.1 基本培養(yǎng)基

保加利亞乳桿菌的基本培養(yǎng)基配方見(jiàn)表1。配制過(guò)程中，維生素和無(wú)機(jī)鹽用0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌，其余溶解后115℃ 20 min滅菌。臨用時(shí)按比例混合。

1.3.1.2 復(fù)合氨基酸培養(yǎng)基

用20種氨基酸代替表1中的8種氨基酸，其中每升培養(yǎng)基中加入半胱氨酸0.4 g，天門冬氨酸0.3 g，谷氨酸0.3 g，另外16種氨基酸各加0.2 g，氨基酸添加總量為4.2 g/L。其余成分和配制方法與基本培養(yǎng)基相同。

1.3.1.3 蛋白水解物培養(yǎng)基

表1 保加利亞乳桿菌生長(zhǎng)基本培養(yǎng)基組成

用大豆蛋白水解液代替基本培養(yǎng)基中的8種氨基酸，添加量為5.0 mL/100mL，多肽和氨基酸添加總量為1.51 g/L。其余成分和配制方法同基本培養(yǎng)基。

1.3.2 嗜熱鏈球菌培養(yǎng)基

1.3.2.1 基本培養(yǎng)基

嗜熱鏈球菌的基本培養(yǎng)基配方見(jiàn)表2。

表2 嗜熱鏈球菌生長(zhǎng)的基本培養(yǎng)基組成

配制時(shí)，維生素和無(wú)機(jī)鹽用0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌，其余溶解后115℃ 20 min滅菌。臨用時(shí)按比例混合。

1.3.2.2 復(fù)合氨基酸培養(yǎng)基

用20種氨基酸代替基本培養(yǎng)基中的7種氨基酸，其中培養(yǎng)基中加入半胱氨酸0.4 g/L，天門冬氨酸0.3 g/L，谷氨酸0.3 g/L，另外16種氨基酸按0.2 g/L添加，氨基酸添加總量為4.2 g/L。其余成分與配制方法同基本培養(yǎng)基。

1.3.2.3 蛋白水解物培養(yǎng)基

配制方法同1.3.1.3。

1.4 方法

1.4.1 乳酸菌化學(xué)限定培養(yǎng)基生長(zhǎng)分析

將活化3代的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌MRS 12 h培養(yǎng)物3 000 r/min離心10 min，去上清液，沉淀細(xì)胞洗2次后，調(diào)整細(xì)胞濃度為106～107個(gè)/mL。以2%接種量分別接種保加利亞乳桿菌基本培養(yǎng)基、復(fù)合氨基酸培養(yǎng)基和蛋白水解物培養(yǎng)基，充分搖勻。無(wú)菌條件下分裝于滅菌的試管中，每管5.0 mL，置37℃培養(yǎng)。從0 h開(kāi)始每隔2 h以3種空白培養(yǎng)基調(diào)零，在600 nm處測(cè)定OD值，同時(shí)測(cè)定pH值。

按μ=(X2-X1)/T，計(jì)算生長(zhǎng)速率

式中:μ為生長(zhǎng)速率;X2和X1分別為T時(shí)間的OD值。

1.4.2 乳酸菌在蛋白水解物培養(yǎng)基與MRS培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)比較分析

將活化3代保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌MRS 12 h培養(yǎng)物離心去上清液，細(xì)胞洗2次后，調(diào)整細(xì)胞濃度為106～107個(gè)/mL。以2%接種量分別接種MRS培養(yǎng)基和蛋白水解物培養(yǎng)基，充分搖勻。無(wú)菌條件下分裝于滅菌的試管中，每管5.0 mL，37℃培養(yǎng)。從0h開(kāi)始每隔4h按文獻(xiàn)［5］進(jìn)行乳酸菌計(jì)數(shù)。

1.4.3 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Office Excel 2003處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 保加利亞乳桿菌L2生長(zhǎng)曲線

2.1.1 L2在基本培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線

保加利亞乳桿菌在含有8種氨基酸的基本培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)結(jié)果見(jiàn)圖1，細(xì)菌密度的OD值始終維持在一個(gè)很低的水平，總體看來(lái)細(xì)菌在該培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況很差。0～4 h有一個(gè)上升階段，然后維持一個(gè)水平線上，最后迅速下降。pH值的變化與OD值同步，雖有一個(gè)下降過(guò)程，但幅度很小，一直維持在pH 6.2以上，說(shuō)明該菌的產(chǎn)酸能力很有限。

圖1 L2在基本氨基酸培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線

2.1.2 L2在20種氨基酸培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線

在含有20種氨基酸CDM上，保加利亞乳桿菌生長(zhǎng)過(guò)程如圖2所示。與基本培養(yǎng)基相比，細(xì)胞生長(zhǎng)量可增加3倍，最大生長(zhǎng)速率μmax在0.02/h左右。pH值從初始的pH 6.41下降到pH 4.92，從細(xì)胞密度和產(chǎn)酸量來(lái)看，雖然含有全價(jià)氨基酸，但細(xì)菌生長(zhǎng)狀況不是很好，表明氨基酸并不是保加利亞乳桿菌生長(zhǎng)最佳氮源。

圖2 L2在20種氨基酸培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線

2.1.3 L2在SPH培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線

L2在含有SPH培養(yǎng)基上生長(zhǎng)狀況如圖3所示，生長(zhǎng)量比20種氨基酸有很大改善，可達(dá)到1.425，分別是8種和20種氨基酸培養(yǎng)基的13.4倍和4.1倍。pH值下降到pH 3.94，產(chǎn)酸水平基本可與乳培養(yǎng)基相近。最大生長(zhǎng)速率μmax為0.10/h，是20種氨基酸的5倍。

2.1.4 保加利亞乳桿菌3種培養(yǎng)基生長(zhǎng)曲線比較

圖3 L2在SPH培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線

保加利亞乳桿菌在3種培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀況結(jié)果見(jiàn)圖4和圖5，基本培養(yǎng)基生長(zhǎng)量和產(chǎn)酸量維持一個(gè)很低的水平，說(shuō)明8種氨基酸作為氮源能夠提供細(xì)菌的最低生長(zhǎng)要求。20種氨基酸為細(xì)菌生長(zhǎng)提供比較豐富的氮源，使保加利亞乳桿菌生長(zhǎng)提高3倍。產(chǎn)酸量也有大幅度提高，pH值下降到pH 5.0以下。

圖4 保加利亞乳桿菌在3種培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線

圖5 保加利亞乳桿菌在3種培養(yǎng)基的pH值變化

與MRS和脫脂乳培養(yǎng)基相比還相差很多，說(shuō)明全價(jià)氨基酸并不能為保加利亞乳桿菌菌株獲得最適生長(zhǎng)氮源。用分子量小于5 ku的SPH替代氨基酸作為氮源使保加利亞乳桿菌的生長(zhǎng)狀況大為改觀，最大生長(zhǎng)速率是20種氨基酸的5倍，pH值可下降到pH4.0以下。由此說(shuō)明大豆蛋白水解物是保加利亞乳桿菌生長(zhǎng)的最佳氮源，可獲得相對(duì)較大的生長(zhǎng)量。

2.2 嗜熱鏈球菌S1生長(zhǎng)曲線

2.2.1 S1基本培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線

嗜熱鏈球菌在基本氨基酸培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)結(jié)果如圖6所示，S1在該培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的狀況很差，最大吸光值和最大生長(zhǎng)速率僅為0.046/h和0.0028/h。培養(yǎng)基的pH值經(jīng)過(guò)20 h從pH 6.30下降到pH 6.18，表明含7種氨基酸的基本培養(yǎng)基僅能維持細(xì)菌的最低生長(zhǎng)水平。

圖6 嗜熱鏈球菌在基本氨基酸培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線

圖7 嗜熱鏈球菌在20種氨基酸培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線

圖8 嗜熱鏈球菌在SPH培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線

2.2.2 S1在20種氨基酸培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線

在20種氨基酸培養(yǎng)基上嗜熱鏈球菌的生長(zhǎng)狀況和7種氨基酸相比有很大增長(zhǎng)，結(jié)果見(jiàn)圖7。最大OD值和最大生長(zhǎng)速率分別為0.277/h和0.024/h。在生長(zhǎng)過(guò)程中，乳酸菌的產(chǎn)酸量也大幅增加，pH值從起初的pH 6.29下降到pH 4.45。

2.2.3 嗜熱鏈球菌在SPH培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線

圖8是嗜熱鏈球菌在添加SPH的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀況，與20種全價(jià)氨基酸培養(yǎng)基相比細(xì)胞生長(zhǎng)量大幅度提高，在穩(wěn)定期時(shí)OD值最高達(dá)到1.434，為20種氨基酸培養(yǎng)基的5倍多。最大生長(zhǎng)速率達(dá)到0.12/h，也為20種氨基酸培養(yǎng)基的5倍。

2.2.4 嗜熱鏈球菌在3種培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀況比較

圖9和圖10分別是嗜熱鏈球菌在3種培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)胞量和pH值變化圖，可以看出，嗜熱鏈球菌在基本培養(yǎng)基上細(xì)胞量只維持最低生長(zhǎng)水平，20種氨基酸培養(yǎng)基雖能夠?yàn)榧?xì)菌生長(zhǎng)提供全價(jià)的氨基酸，但是生長(zhǎng)狀況遠(yuǎn)不如添加SPH的培養(yǎng)基。

圖9 嗜熱鏈球菌在3種培養(yǎng)基生長(zhǎng)量的比較

圖10 嗜熱鏈球菌在3種培養(yǎng)基中的pH值的比較

由圖10可知，pH值與生長(zhǎng)量變化之間存在同步關(guān)系。在基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)水平很低，所反映的pH值變化是一條水平直線。在全價(jià)氨基酸培養(yǎng)基上，pH值呈現(xiàn)出一個(gè)緩慢的下降通道，說(shuō)明隨著細(xì)菌生長(zhǎng)有個(gè)逐漸形成乳酸的過(guò)程。在SPH培養(yǎng)基上，pH值變化是由一個(gè)迅速的下降階段和一個(gè)平緩的延伸階段組成，說(shuō)明乳酸形成過(guò)程首先是一個(gè)與對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期相對(duì)應(yīng)的快速產(chǎn)酸期，然后當(dāng)細(xì)菌生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期后產(chǎn)酸趨于平緩。

2.3 乳酸菌在MRS培養(yǎng)基的生長(zhǎng)狀況

圖11和圖12是保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌在MRS培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線和pH值變化關(guān)系圖。從生長(zhǎng)量來(lái)看，兩種細(xì)菌的最大生長(zhǎng)速率分別可達(dá)到0.215/h和0.262/h，與圖3和圖8中二菌在SPH培養(yǎng)基的最大生長(zhǎng)速率0.10/h和0.12/h相比，兩者存在倍增關(guān)系，表明MRS更適合乳酸菌生長(zhǎng)。

圖11 保加利亞乳桿菌在MRS培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線

圖12 嗜熱鏈球菌在MRS培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線

從pH值的變化情況來(lái)看，保加利亞乳桿菌從2 h開(kāi)始時(shí)迅速下降，到達(dá)14 h后呈現(xiàn)一個(gè)平緩下降過(guò)程，最終穩(wěn)定在pH 3.6左右。嗜熱鏈球菌產(chǎn)酸相對(duì)于保加利亞乳桿菌雖然下降也較迅速，但到達(dá)10 h后仍有一個(gè)緩慢的下降過(guò)程，最終定位在pH 3.8左右。二者相比保加利亞乳桿菌產(chǎn)酸能力較強(qiáng)一些。

圖13 S1在3種培養(yǎng)基中的細(xì)胞生長(zhǎng)數(shù)量

圖14 L2在3種培養(yǎng)基中的細(xì)胞生長(zhǎng)數(shù)量

圖13和圖14分別是嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌在全價(jià)氨基酸培養(yǎng)基、SPH培養(yǎng)基和MRS培養(yǎng)基中細(xì)菌細(xì)胞數(shù)量結(jié)果比較圖，在MRS培養(yǎng)基中兩種乳酸菌的細(xì)胞數(shù)量可達(dá)1010CFU/mL以上，SPH培養(yǎng)基的乳酸菌數(shù)量在109～1010CFU/mL，且接近1010數(shù)量級(jí)，20種全價(jià)氨基酸培養(yǎng)基的細(xì)胞數(shù)量在108CFU/mL以下。

2.4 乳酸菌生長(zhǎng)對(duì)氮源的需要

從L2和S1在基本氨基酸、全價(jià)氨基酸和SPH 3種培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀況來(lái)看，基本氨基酸包括谷氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、纈氨酸和精氨酸等是乳酸菌生長(zhǎng)的必需氨基酸［2］，只滿足乳酸菌生長(zhǎng)氮源的最低要求。對(duì)于部分乳酸菌，同時(shí)添加天冬酰胺和谷氨酰胺后生長(zhǎng)達(dá)到基本要求［4］。20種全價(jià)氨基酸與富含有分子量低于5ku短肽和游離氨基酸的大豆蛋白水解物相比，雖然添加大豆蛋白水解物的量只是20種氨基酸的1/3，但其最大生長(zhǎng)速率是全價(jià)氨基酸的5倍，說(shuō)明蛋白水解物中富含有更易被乳酸菌生長(zhǎng)利用的最佳氮源。

2.4.1 乳酸菌的氮源轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)

乳酸菌的氮源轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)主要包括3種體系，一是以游離氨基酸的方式進(jìn)入細(xì)胞，二是通過(guò)二肽或三肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，三是依靠寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)一是依靠質(zhì)子動(dòng)力二肽載體，另一是依靠能量轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，后者主要轉(zhuǎn)運(yùn)4～6個(gè)氨基酸的寡肽，系統(tǒng)極大可能由ATP驅(qū)動(dòng)或與富含能量的磷酸鹽中間底物有關(guān)［5］。通過(guò)恒化培養(yǎng)生長(zhǎng)細(xì)胞內(nèi)部的氨基酸池分析顯示，芳香族氨基酸主要以高稀釋比率通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散的方式進(jìn)入細(xì)胞［6］。在乳中，乳酸菌利用蛋白酶水解乳蛋白形成多肽生長(zhǎng)，多肽被吸收后被水解成氨基酸釋放到培養(yǎng)基中供細(xì)菌內(nèi)生長(zhǎng)需要，生長(zhǎng)依賴寡肽作為氮源占98%，其寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)在利用肽方面起到至關(guān)重要的作用［7］。2種乳酸菌在3種培養(yǎng)基中的狀況說(shuō)明，乳酸菌在SPH培養(yǎng)基中比在全價(jià)氨基酸培養(yǎng)基中獲得更好的生長(zhǎng)，與其乳酸菌氮源轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)密切相關(guān)。

2.4.2 化學(xué)限定培養(yǎng)基與MRS培養(yǎng)基的比較

雖然富含有5 ku多肽和氨基酸的SPH能夠使乳酸菌獲得很好生長(zhǎng)，但乳酸菌生長(zhǎng)比MRS培養(yǎng)基低0.5～1個(gè)數(shù)量級(jí)，培養(yǎng)基的綜合效能不及半合成培養(yǎng)基MRS，這可能是由于在MRS培養(yǎng)基中的蛋白胨、牛肉膏和酵母膏中的組成成分如蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸和維生素等對(duì)滿足乳酸菌生長(zhǎng)更全面、有效。然而從生長(zhǎng)曲線的走勢(shì)來(lái)看，乳酸菌在SPH培養(yǎng)基中的細(xì)胞活性維持在一水平線上，MRS和全價(jià)氨基酸培養(yǎng)在進(jìn)入穩(wěn)定期后細(xì)胞數(shù)量呈下降趨勢(shì)，這也許是蛋白水解物中形成對(duì)細(xì)菌有毒副作用的產(chǎn)物相對(duì)少的緣故［8］。

3 結(jié)論

利用化學(xué)限定培養(yǎng)基對(duì)酸奶乳酸菌進(jìn)行增殖作用研究，結(jié)果表明必需氨基酸只能滿足乳酸菌生長(zhǎng)的基本氮源需要，20種全價(jià)氨基酸雖然可使保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的最大生長(zhǎng)速率顯著提高，產(chǎn)酸能力明顯增強(qiáng)，但遠(yuǎn)不及大豆蛋白水解物的增殖效果。用分子質(zhì)量小于5ku的SPH代替全價(jià)氨基酸可使乳酸菌細(xì)胞密度增加4倍，最大生長(zhǎng)速率增加1倍。因此說(shuō)明能夠使乳酸菌迅速增殖的最佳氮源是蛋白水解物中的寡肽，而不是氨基酸，大豆蛋白水解物可以用作乳酸菌高密度培養(yǎng)添加物。

乳酸菌作為一特殊的細(xì)菌類群在食品發(fā)酵、保健醫(yī)療等領(lǐng)域具有非常重要的作用，由于乳酸菌的代謝特征，一直限制乳酸菌的高密度細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。本研究通過(guò)化學(xué)限定培養(yǎng)基應(yīng)用大豆蛋白水解物對(duì)保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌進(jìn)行增殖作用研究，結(jié)果表明含有寡肽和氨基酸的大豆蛋白水解物對(duì)乳酸菌的生長(zhǎng)具有明顯的促進(jìn)作用，可以用來(lái)作為乳酸菌高密度細(xì)胞培養(yǎng)體系的生長(zhǎng)促進(jìn)劑。

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