王濤，游玲，趙東，馮瑞章，王松，馮學(xué)愚，張?jiān)?/p>

1(宜賓學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，四川 宜賓，644000)2(發(fā)酵資源與應(yīng)用四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川宜賓，644000)3(五糧液股份公司，四川宜賓，644000)

在我國(guó)白酒行業(yè)中，濃香型白酒產(chǎn)量和收入均占到了行業(yè)收入的75%以上［1］。“以麥制大曲、用大曲釀酒”是我國(guó)濃香型白酒釀造工藝中的一項(xiàng)傳統(tǒng)操作技術(shù)，濃香型白酒使用的大曲主要為中高溫大曲，在濃香型大曲酒的生產(chǎn)中用量一般為投糧量的20%～30%，它不僅為濃香型白酒發(fā)酵提供多種復(fù)合酶系、部分發(fā)酵菌種，還提供一些香味物質(zhì)及香味物質(zhì)的前體物質(zhì)和部分發(fā)酵原料［2］。所以大曲中的微生物區(qū)系、酶系和各種物質(zhì)在很大程度上決定了濃香型白酒的風(fēng)味、口感及品質(zhì)，也反映了大曲內(nèi)在質(zhì)量與大曲酒品質(zhì)間存在極為密切的關(guān)系，所謂“曲者，酒之骨也”［3］。

中高溫大曲的生產(chǎn)是以小麥為原料，自然接種，生料制坯，低溫培菌，高溫轉(zhuǎn)化，入庫(kù)貯存。由于中高溫大曲在曲房中生產(chǎn)，因此曲房環(huán)境中的微生物群落與大曲微生物群落組成有著直接的關(guān)系。自20世紀(jì)70年代以來(lái)，國(guó)內(nèi)利用經(jīng)典微生物和免培養(yǎng)(cultureindependent)的方法對(duì)中高溫大曲和曲房中的細(xì)菌群落進(jìn)行了研究［4－6］。盡管這些研究在認(rèn)識(shí)中高溫大曲細(xì)菌群落起到了較大的作用，但對(duì)中高溫大曲和制曲環(huán)境中的微生物群落較為系統(tǒng)的信息提供不足。

宜賓是我國(guó)濃香型大曲的主要產(chǎn)地，以“五糧液”為代表的宜賓多糧濃香型白酒在全國(guó)的濃香型白酒產(chǎn)業(yè)中占有重要地位。對(duì)宜賓中高溫大曲生產(chǎn)中涉及的細(xì)菌開(kāi)展較為系統(tǒng)的研究，對(duì)于探討中高溫大曲的發(fā)酵機(jī)理、改進(jìn)生產(chǎn)工藝、穩(wěn)定或提高優(yōu)質(zhì)大曲的產(chǎn)量具有重要意義。同時(shí)，這些微生物也是一類(lèi)重要的生物資源，具有較為廣泛潛在應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

選取宜賓6家規(guī)模以上多糧濃香型白酒生產(chǎn)企業(yè)采樣，采樣時(shí)間為2008年3～4月。曲房空氣樣點(diǎn)采樣采用自然沉降法，取樣平板暴露在空氣中5 min;大曲樣品為各企業(yè)自制中高溫小麥大曲(使用曲)，每個(gè)企業(yè)3塊以上大曲。

1.2 培養(yǎng)基

采用改良牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(NA)分離細(xì)菌、改良的高氏I號(hào)培養(yǎng)基分離放線(xiàn)菌。每1 000 mL培養(yǎng)基含100 mL大曲的無(wú)菌水浸提液及50 000 U制霉菌素。大曲的無(wú)菌水浸提液制備方法為曲藥100 g混合后加入500 mL水，充分?jǐn)嚢杌靹颍?15℃滅菌30 min后無(wú)菌紗布過(guò)濾。

1.3 方法

1.3.1 分離

大曲整塊破碎后，過(guò)30目篩(各企業(yè)的樣品單獨(dú)分離)。按照10倍梯度稀釋的方法，每個(gè)稀釋梯度涂布20個(gè)平板，30℃培養(yǎng)。定期觀(guān)察分離平板，挑取單菌落劃線(xiàn)純化于常規(guī)NA或高氏I號(hào)斜面上。根據(jù)菌落的顏色、大小、突起特征、邊緣特征、表面光滑與否和透明度等肉眼可辯的特征去除冗余。在分離過(guò)程中，在分離平板中加入了曲藥的水浸液，盡量模擬了曲藥生產(chǎn)相關(guān)細(xì)菌的生活環(huán)境，保證了其盡可能地被分離到。

1.3.2 DNA提取與PCR擴(kuò)增

根據(jù)文獻(xiàn)［7］方法適當(dāng)修改，提取菌株基因組DNA、擴(kuò)增出16S rRNA基因片段。引物27f:5'－AGAGTTTGATCTGGCTCAG－3'和1541 r:5'－AAGGAGGTGATC CAGCCGCA －3'［8］。擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司(Sangon)純化并測(cè)序，測(cè)序長(zhǎng)度700－900 bp，序列GenBank序列號(hào)見(jiàn)圖1。

1.3.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

所得序列用EzTaxon server 2.0［9］在線(xiàn)進(jìn)行相似性分析。用ClustalX按照最大同源性的原則進(jìn)行比對(duì)，采用 Kimura-2［10］計(jì)算序列相似值，并用 BioEdit 5.0.9進(jìn)行檢驗(yàn);采用Mega 4.0進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建、編輯與保存。對(duì)聚在一條直線(xiàn)的菌株，通過(guò)ClustalX比對(duì)確定其序列相似度＞99.50%后，合并成一個(gè)類(lèi)群。

1.3.4 細(xì)菌釀造性能評(píng)價(jià)

細(xì)菌采用NA培養(yǎng)基活化24～36 h制成菌懸液(濃度108個(gè)/mL)，典型絲狀放線(xiàn)菌采用ISP2培養(yǎng)基平板活化48～72 h。

水解淀粉能力測(cè)定參照文獻(xiàn)［11］中的方法適當(dāng)修改進(jìn)行;纖維素利用能力測(cè)定參照文獻(xiàn)［12］進(jìn)行;7%乙醇耐受能力檢測(cè)、pH 4.5酸耐受能力檢測(cè)參照文獻(xiàn)［13］中的方法適當(dāng)修改進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 中高溫大曲和曲房中細(xì)菌的分離

對(duì)分離得到的大量菌株通過(guò)表觀(guān)特征去除冗余后，得到217株純培養(yǎng)物，其中曲房中分離得到170株，大曲47株。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

2.2.1 曲房和曲藥可培養(yǎng)細(xì)菌的多樣性

對(duì)217株細(xì)菌的16S rRNA基因進(jìn)行測(cè)序，共得到217條有效序列，經(jīng)序列比對(duì)、相似性分析和系統(tǒng)發(fā)育分析(表1，圖1)發(fā)現(xiàn)宜賓中高溫大曲及曲房中細(xì)菌體現(xiàn)出較為豐富的系統(tǒng)發(fā)育多樣性。217株細(xì)菌中有1株菌(H7B－55，分離自大曲)與數(shù)據(jù)庫(kù)中近緣類(lèi)群典型菌株(Bacillus horneckiae 1P01SCT)序列相似性低于97%(96.58%)，可能代表新分類(lèi)單位［14］;其余216株與分屬于16個(gè)屬的52個(gè)種的典型菌株序列相似性大于97%。

表1 純培養(yǎng)菌株16SrRNA基因序列的相似性分析

續(xù)表1

從中高溫大曲中分離得到47株菌，除1株代表潛在新分類(lèi)單位外，其余菌株分屬于6個(gè)屬，與14個(gè)種的典型菌株相似性大于97%。其中，屬于Bacillus屬的菌株有35株，占大曲分離菌株總數(shù)的77.78%，占據(jù)了絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。其余各屬數(shù)量較少，除Staphylococcus和 Enterobacter分別有 5株和 3株外，Arthrobacter、Exiguobacterium、Lysinibacillus均分別只有 1株菌。

從曲房分離得到的170株在16個(gè)屬中均有分布，其中分屬于Bacillus和Streptomyces的菌株分別有89株、37株，各占曲房空氣中分離出菌株總數(shù)的52.32%、21.76%。該2屬為此次分離得到的曲房空氣的優(yōu)勢(shì)屬，屬于該2屬的菌株共有126株，占曲房分離細(xì)菌總數(shù)的74.06%。除此2屬外，屬于Staphylococcus的菌株有16株、Lysinibacillus8株，其余各屬菌株均在5株以下，還有7個(gè)屬的均只有1株菌。

2.2.2 曲房和曲藥可培養(yǎng)細(xì)菌群落的相似性比較

無(wú)論從得到菌株的數(shù)量還是菌株分類(lèi)單位，曲房中細(xì)菌的數(shù)量都要遠(yuǎn)高于中高溫大曲。從屬一級(jí)分類(lèi)單位來(lái)看，大曲中分離到的屬在曲房中均能夠被發(fā)現(xiàn)。但從16S rRNA基因序列的相似性分析(表1)和菌株系統(tǒng)發(fā)育分析(圖1)來(lái)看，盡管大曲與曲房絕大多數(shù)菌株系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系極為接近，但大曲中分離出的潛在新分類(lèi)單位菌株H7B-55(序列號(hào)HQ832936)與所有曲房中分離出的菌株親緣關(guān)系均較遠(yuǎn)(圖1)。同時(shí)，在曲房中占據(jù)一定優(yōu)勢(shì)地位的Streptomyces屬的菌株卻在大曲中沒(méi)有被分離到。

圖1 曲房和大曲細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育分析

2.3 細(xì)菌的釀造性能評(píng)價(jià)

217株菌的纖維素分解能力、淀粉水解能力、乙醇耐受和低pH耐受能力初步分析的結(jié)果如表2。

表2 細(xì)菌的釀造性能初步評(píng)價(jià)

從表2可以看出，此次分離的細(xì)菌中沒(méi)有能夠耐受pH 4.5的菌株。而具有纖維素分解能力、淀粉水解能力和耐受7%乙醇的菌株分別有25株、71株和16株，分別占菌株總數(shù)的11.52%、32.72%和7.37%。而且這些菌株以Bacillus屬的菌株為主，能夠利用纖維素的25株菌中就有17株屬于該屬;具備淀粉水解能力的71株菌中，該屬也占到65株;耐受乙醇的16株菌中，該屬也占到了12株。此外，曲房中分離得到的170株細(xì)菌中，具有淀粉水解能力的菌株達(dá)64株，占曲房菌株數(shù)的37.65%，達(dá)到了相當(dāng)?shù)谋壤?/p>

無(wú)論從菌株分類(lèi)單位和具體的菌株來(lái)看，大曲和曲房中具備上述3種能力之一的菌株具有高度的一致性。大曲中具有纖維素利用能力的5株菌在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖1)上，屬于類(lèi)群1的有2株(序列號(hào)JF322937、JF322965)，類(lèi)群6、類(lèi)群7和類(lèi)群10各有1株(序列號(hào)分別為 HQ238926、JF322969和HQ238921)，而在同樣的類(lèi)群中均有具有纖維素利用能力的曲房細(xì)菌(類(lèi)群1:HQ238751、HQ238754;類(lèi)群6:JF322990、JF322963;類(lèi)群 7:HQ238830;類(lèi)群10:HQ238759、HQ238829、HQ238761)。而具有淀粉水解能力的7株大曲細(xì)菌，在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上分屬于類(lèi)群1(HQ238925，JF322937)、類(lèi)群 6(HQ238926)、類(lèi)群 7(JF322976)和類(lèi)群 8(JF322940，HQ238935，JF322973)，而曲房中屬于該4個(gè)類(lèi)群的細(xì)菌具有淀粉水解能力的菌株總數(shù)達(dá)到了32株(具體菌株序列號(hào)未列出)。同樣，大曲中屬于Staphylococcus的1株菌位于發(fā)育樹(shù)上類(lèi)群2中(HQ238730)，而在該類(lèi)群中可以找到2株耐受乙醇的曲房細(xì)菌(HQ238737，HQ238810);其余屬于Bacillus的5株大曲耐受乙醇菌株也分別與曲房耐受乙醇菌株在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上聚在不同的類(lèi)群(類(lèi)群1:大曲JF322937、JF322989，曲房 HQ238751、HQ238791、HQ238793;類(lèi)群 5:大曲HQ238933-934， 曲 房 HQ238859、 HQ238758，JF32292;類(lèi)群7:大曲 JF322976，曲房 F322929;類(lèi)群8:大曲JF322960，曲房JF32292)。由于在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上，能夠聚在1個(gè)類(lèi)群(在樹(shù)上表現(xiàn)為同一條直線(xiàn))上的菌株的序列的相似性均在99.50%以上(經(jīng)過(guò)驗(yàn)證)，所以大曲中具備3種能力之一的菌株都能能夠在曲房環(huán)境中發(fā)現(xiàn)與其親緣關(guān)系極為接近(或相同)的菌株。

此外，通過(guò)菌株部分釀造性能分析，發(fā)現(xiàn)有些菌株具備2種以上的釀造特性，如分離自大曲的1044號(hào)菌株(序列號(hào) JF322937)同時(shí)具備纖維素利用、淀粉水解和7% 乙醇耐受能力;分離自曲房的GB-112菌株(序列號(hào) HQ238751)和大曲的 J9B-7(序列號(hào)JF322976)分別同時(shí)具備纖維素分解、耐受乙醇能力和淀粉水解、耐受乙醇能力。這些菌株有待于進(jìn)一步的研究，以探討它們?cè)谥魄搬劸浦袘?yīng)用的可能性。

3 討論

盡管從曲房中分離得到的菌株分屬于16個(gè)屬，但屬于Bacillus和Streptomyces屬的菌株占到了74.06%。Bacillus屬的菌株可產(chǎn)生抗逆性極強(qiáng)的芽孢，Streptomyces為典型絲狀、產(chǎn)孢放線(xiàn)菌，它們產(chǎn)生芽孢或孢子可以使其種群耐受環(huán)境的不斷的變化，從而得以長(zhǎng)期延續(xù)，使大曲生產(chǎn)區(qū)域的細(xì)菌群落保持相對(duì)的穩(wěn)定性。同時(shí)，曲房中分離到了相當(dāng)比例的具有淀粉水解能力和纖維素分解能力的細(xì)菌，也表明經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的大曲生產(chǎn)，曲房中的細(xì)菌群落與大曲的生產(chǎn)是密切相關(guān)的。

本研究從大曲中分離得到了分屬于6個(gè)屬的47株菌，經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)其中Bacillus屬為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)屬，這與張明春［15］等、孟鎮(zhèn)［6］等的研究結(jié)果是一致的。但胡佳等［16］和高亦豹等［4］在利用免培養(yǎng)方法研究大曲中細(xì)菌區(qū)系時(shí)均沒(méi)有檢測(cè)到Bacillus的存在。而本研究發(fā)現(xiàn)Staphylococcus為大曲中的次優(yōu)勢(shì)屬(5株菌)，這又與高亦豹等［4］的研究結(jié)果一致。同時(shí)，比較孟鎮(zhèn)［6］、胡佳［16］和高亦豹［4］等的研究，發(fā)現(xiàn)他們的研究結(jié)果差異較大。出現(xiàn)上述情況的原因，除了因?yàn)榇笄情_(kāi)放式生產(chǎn)、自然接種，原料、環(huán)境、工藝對(duì)大曲微生物區(qū)系均有直接影響而導(dǎo)致不同的大曲微生物區(qū)系差異化較大外，還與純培養(yǎng)和免培養(yǎng)研究手段自身的缺陷有關(guān)［17］。所以，在現(xiàn)在的技術(shù)手段下，欲充分闡明中高溫大曲中的細(xì)菌群落，應(yīng)大面積、長(zhǎng)時(shí)間的采樣，采用多種方法對(duì)大曲微生物進(jìn)行解析。本研究中，大曲中Bacillus屬的細(xì)菌占據(jù)了絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，而且該屬細(xì)菌也是其他傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵工業(yè)中的常見(jiàn)細(xì)菌，如在泰國(guó)北部的傳統(tǒng)發(fā)酵木薯食品中該屬菌株占到了總菌數(shù)的一半以上［18］，也是印度、意大利等地的傳統(tǒng)豆類(lèi)發(fā)酵食品中的優(yōu)勢(shì)菌株［19］。Staphylococcus屬細(xì)菌也曾在多種傳統(tǒng)發(fā)酵食品中被分離到，如香腸、魚(yú)醬等［20－21］。

盡管是廣泛的采樣樣品，大曲中分離得到的細(xì)菌無(wú)論是數(shù)量還是多樣性都要遠(yuǎn)低于曲房，這與中高溫大曲的生產(chǎn)實(shí)際及本次采集的樣品為使用曲的實(shí)際情況是吻合的。中高溫曲，從制曲到后熟成為使用曲要經(jīng)歷至少3個(gè)月的時(shí)間，而且在制曲過(guò)程中還要經(jīng)歷一個(gè)高溫階段(65℃左右)，這些均導(dǎo)致大曲中細(xì)菌數(shù)量和多樣性減少。在曲房中分離到了較多的Streptomyces屬的菌株(37株)，但在大曲中卻沒(méi)有被分離到，而且目前已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道了從中高溫大曲中檢測(cè)到了Streptomyces屬的菌株。加之目前國(guó)內(nèi)對(duì)典型絲狀放線(xiàn)菌在白酒釀造過(guò)程中的作用的報(bào)道極少，所以有必要系統(tǒng)開(kāi)展典型絲狀放線(xiàn)菌在大曲及白酒釀造中的作用的研究。

從中高溫大曲中分離得到細(xì)菌所屬的屬一級(jí)分類(lèi)單位在曲房中均可以找到。更為重要的是，大曲中具備乙醇耐受、纖維素分解、淀粉水解能力的菌株，都能夠在曲房中找到與之16S rDNA序列近乎100%相似的菌株，這充分表明大曲中細(xì)菌群落與生產(chǎn)環(huán)境細(xì)菌群落有直接關(guān)系。同時(shí)，本次分離采用的是使用曲，使用曲中分離到能夠耐受較高濃度乙醇的細(xì)菌，表明這些細(xì)菌很可能參與糟醅發(fā)酵。所以，在大曲(使用曲)中分離到一定數(shù)量(6株)來(lái)自于曲房空氣且能夠耐受較高乙醇濃度的菌株，在相當(dāng)程度上證明優(yōu)質(zhì)白酒的生產(chǎn)與生產(chǎn)環(huán)境有密切的關(guān)系。

H7B-55(序列號(hào)HQ832936)在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上(圖1)處于單獨(dú)的一簇，與此次分離到的其他細(xì)菌具有較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系。同時(shí)，由于這株菌與目前GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中所有模式菌株序列相似性均小于97%，推測(cè)這株菌很可能來(lái)自于制曲小麥的內(nèi)生細(xì)菌。由于中高溫大曲是生料制曲，原料(小麥)中的內(nèi)生菌必然會(huì)對(duì)大曲微生物區(qū)系產(chǎn)生影響，而在以往關(guān)于大曲微生物區(qū)系的研究中，研究者們通常沒(méi)有考慮到這一問(wèn)題。而在國(guó)外已有關(guān)于混菌固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中，原材料(植物)內(nèi)生菌區(qū)系會(huì)對(duì)發(fā)酵微生物區(qū)系產(chǎn)生影響的報(bào)道［22］。所以以后系統(tǒng)研究大曲微生物區(qū)系時(shí)必須充分考慮原材料內(nèi)生菌區(qū)系對(duì)大曲質(zhì)量的影響。

本研究首次較為系統(tǒng)地研究了宜賓中高溫大曲及其生產(chǎn)場(chǎng)所空氣的細(xì)菌群落，獲得了大量的純培養(yǎng)菌株。并從中高溫大曲生產(chǎn)工藝和濃香型白酒釀造的角度對(duì)大曲和生產(chǎn)場(chǎng)所的細(xì)菌群落相關(guān)性進(jìn)行了探討，對(duì)于最終闡明大曲的發(fā)酵機(jī)理、統(tǒng)一中高溫大曲質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了支撐，還獲得了大量的潛在微生物資源。

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