張波，管政兵，謝廣發(fā)，陸健，余培斌

1(江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫，214122)2(江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無(wú)錫，214122)3(浙江古越龍山紹興酒股份有限公司，浙江 紹興，312000)

麥曲在黃酒釀造中占有極重要的地位，其質(zhì)量的優(yōu)劣，直接影響著黃酒的產(chǎn)量和質(zhì)量，因此麥曲又有“酒之骨”的美譽(yù)［1］。傳統(tǒng)的黃酒釀造采用的是自然固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)的生麥曲，以小麥為原料，通過(guò)網(wǎng)羅自然界中微生物，在堆放車間中進(jìn)行自然接種，使附著在小麥表面的微生物生長(zhǎng)繁殖并代謝產(chǎn)生各種代謝產(chǎn)物［2－3］。制曲過(guò)程也就是在微生物的參與下，發(fā)生著一系列的生物化學(xué)變化的過(guò)程。通常整個(gè)制曲過(guò)程根據(jù)麥曲品溫的變化分為6個(gè)階段:起始期(麥曲制作成型后堆放在曲房的第1天)，發(fā)酵前期(麥曲進(jìn)入曲房的第2天)，升溫期(第3天，微生物大量繁殖并開(kāi)始產(chǎn)熱，麥曲品溫逐漸上升)，高溫期(第4天，麥曲品溫達(dá)到最高溫度51～55℃，耐熱性差的微生物因高溫環(huán)境而失活死亡，而一些霉菌則停止生長(zhǎng)，產(chǎn)生孢子)，降溫期(第5～7天，及時(shí)的開(kāi)窗通風(fēng)措施使得麥曲品溫逐漸回落)，成熟期(培養(yǎng)至25～30天，麥曲品溫與室溫相近，麥曲中水分含量逐漸降低，微生物停止生長(zhǎng)，麥曲已結(jié)成硬塊，即已成熟)。由于麥曲品溫和水分含量的變化，不同時(shí)期麥曲中參與發(fā)酵的微生物不同，所參與的反應(yīng)以及產(chǎn)酶情況也有所不同［3－5］。

目前對(duì)黃酒麥曲制曲過(guò)程的研究，一般多是通過(guò)酶活力的測(cè)定來(lái)研究制曲過(guò)程中主要水解酶系的活力變化，而對(duì)于這些同功酶的構(gòu)成及其來(lái)源等，往往不能進(jìn)行全面而有效的分析［6］。在麥曲制曲過(guò)程中微生物群落的動(dòng)態(tài)變化研究方面，目前主要是利用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)鑒定結(jié)合分子生態(tài)學(xué)方法，如核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列分析(RISA)、變性梯度凝膠電泳(DGGE)［7－9］。然而，利用這些方法所獲得的研究結(jié)果無(wú)法將麥曲中存在的特定微生物與其分泌的特定胞外酶聯(lián)系起來(lái)，從而達(dá)到深入理解黃酒麥曲固態(tài)發(fā)酵機(jī)理的目的。近幾年來(lái)迅速發(fā)展起來(lái)的宏蛋白質(zhì)組學(xué)理論和技術(shù)將可能解決這一問(wèn)題。

目前主要應(yīng)用于環(huán)境微生物生態(tài)系統(tǒng)研究的宏蛋白質(zhì)組學(xué)，其定義是運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)微生物群落進(jìn)行研究的一項(xiàng)新技術(shù)，是從微生物群落的所有蛋白質(zhì)水平上直觀揭示復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)中微生物的功能及其變化［10－11］。本研究利用宏蛋白質(zhì)組學(xué)的理論和方法，將麥曲樣品浸提液中所有可溶性蛋白定義為待研究的“宏蛋白質(zhì)組”，對(duì)麥曲制曲過(guò)程中的宏蛋白質(zhì)組動(dòng)態(tài)變化情況進(jìn)行分析，所獲得的研究結(jié)果將有助于深入理解麥曲發(fā)酵過(guò)程機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2010年夏秋，在紹興某黃酒廠制曲車間跟蹤兩批麥曲在制曲過(guò)程中的溫度和水分含量變化，分別采集第1天(起始期)、第2天(發(fā)酵前期)、3天(升溫期)、4天(高溫期)、6天(降溫期)和30天(成熟期)的麥曲，作為制曲過(guò)程中6個(gè)典型時(shí)期樣品［12］。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

瓊脂糖、溴酚藍(lán)、二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰銨(IAA)、固相 IPG 干膠條(18cm，pH3～10，非線性)、IPG緩沖液(pH3 ～10，非線性)、3-［(3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基］-1-丙磺酸(CHAPS)、N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(TEMED)、尿素，為GE公司產(chǎn)品。IPG覆蓋液、RCDC蛋白定量試劑盒，為Bio-Rad公司產(chǎn)品。Complete蛋白酶抑制劑混合片，為Roche公司產(chǎn)品。丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、十二烷基磺酸鈉(SDS)、過(guò)硫酸銨、考馬斯亮藍(lán)G-250、考馬斯亮藍(lán)R-250，為上海生工進(jìn)口分裝產(chǎn)品。甲醇、正丁醇、甘油、冰醋酸、磷酸、三氯乙酸(TCA)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸、丙酮、乙酸鈉、牛血清白蛋白，均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

等電聚焦電泳儀Ettan IPGphor 3、Ettan DALTsix垂直電泳系統(tǒng)和ImageScanner掃描儀，均為GE公司產(chǎn)品;CR22G型高速冷凍離心機(jī)，日本日立公司;Pico＆Fresco17微量高速冷凍離心機(jī)，Thermo公司;UV-2100型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，尤尼柯儀器有限公司;脫色搖床TS-1，海門市其林貝爾儀器公司。

1.1.4 溶液配制

樣品水化液:尿素4.8 g，CHAPS 0.4 g，IPG 緩沖液50 μL，加入雙蒸水至總體積為10 mL(使用前加入50 mmol/L DTT)。

平衡液 I:尿素 72.07 g，SDS 4.0 g，1.5 mol/L Tris-HCl 6.7 mL(pH 8.8)，甘油69 mL，1%溴酚藍(lán)貯存液400 μL，加入雙蒸水至200 mL，使用前每10 mL加入DTT 100 mg。

平衡液 II:尿素 72.07 g，SDS 4.0 g，1.5mol/L Tris-HCl 6.7 mL(pH 8.8)，甘油69 mL，1%溴酚藍(lán)貯存液400 μL，加入雙蒸水至200 mL，使用前每10 mL加入IAA 250 mg。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備

(1)麥曲浸提液的制備:稱取25 g麥曲，加入50 mL 0.1 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(pH 4.2)和1片Complete蛋白酶抑制劑混合片，在4℃條件下浸提過(guò)夜。然后依次用4層紗布過(guò)濾，濾液在12 000 r/min，4℃條件下離心30 min，上清液即為麥曲浸提液。Bradford 法測(cè)定蛋白含量［13］。

(2)TCA-丙酮法沉淀蛋白:取一定量的麥曲浸提液，加入4倍體積的預(yù)冷丙酮溶液I(含20 mmol/L DTT，10%TCA)，搖勻，－20℃放置3 h 沉淀蛋白，之后4℃，12 000 r/min離心30 min。棄上清液，收集沉淀。加入2 mL預(yù)冷的丙酮溶液II(含20 mmol/L DTT)，－20℃放置 1 h，清洗沉淀，4℃，12 000 r/min離心15 min。重復(fù)清洗2次。棄上清液，收集沉淀，然后置于－20℃冰箱中，使丙酮完全揮發(fā)。

(3)沉淀溶解:將干燥好的蛋白質(zhì)沉淀加入適量的樣品水化液，室溫下充分溶解，然后于12 000 r/min離心10 min，上清液即為麥曲宏蛋白質(zhì)組樣品。RC-DC蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白含量。

1.2.2 雙向電泳實(shí)驗(yàn)分析［14］

按照GE公司《雙向電泳操作手冊(cè)》進(jìn)行水化上樣和等電聚焦。吸取350 μL麥曲樣品水化液加入到膠條再泡脹盤(pán)中，取長(zhǎng)度為18 cm，pH 3～10非線性的IPG干膠條水平放入其中，加入少量IPG覆蓋液，水化12 h。水化過(guò)夜后的膠條轉(zhuǎn)移到Ettan IPGphor膠條槽中，進(jìn)行等電聚焦。等電聚焦程序設(shè)置為:Step，50V×2 h;Gradient，150V × 2 h;Gradient，250V × 2 h;Gradient，500V × 2 h;Gradient，1 000V ×2 h;Gradient，5 000V ×2 h;Gradient，10 000V ×2 h;Step，10 000V ×40 000Vh。

等電聚焦結(jié)束后，立即進(jìn)行平衡。采用兩步平衡法，先將IPG膠條放入平衡液I中，在水平搖床上平衡15 min，再使用平衡液II進(jìn)行第2步平衡，在搖床上平衡15 min。

平衡后進(jìn)行第二向SDS-PAGE電泳，分離膠濃度為12.5%(26 cm ×21 cm ×1 mm)。將平衡后的IPG膠條轉(zhuǎn)移到已聚合的聚丙烯酰胺凝膠膠面頂端，用0.5%的瓊脂糖封閉，排除膠條與膠面之間的氣泡。以恒功率方式進(jìn)行電泳:2 W/根膠條，1.5 h，然后調(diào)至16 W/根膠條。

凝膠染色、脫色:剝離凝膠，置于固定液(50%乙醇，10%乙酸)固定1h后，換到考馬斯亮藍(lán)染色液(0.025%考馬斯亮藍(lán)R-250，25%乙醇，10%乙酸)中染色4 h，換脫色液(10%甲醇，10%乙酸)中脫色，直至背景為無(wú)色透明，蛋白點(diǎn)清晰為止。

1.2.3 凝膠掃描及圖譜分析［15］

完成染色的雙向電泳凝膠經(jīng)過(guò)Image ScannerIII凝膠成像系統(tǒng)掃描并保存圖像，圖像使用PDQuest軟件進(jìn)行對(duì)比分析。所有圖像選擇自動(dòng)找點(diǎn)模式，并手動(dòng)校正以去除背景噪音和橫縱條紋。對(duì)不同時(shí)期的麥曲浸提液的雙向電泳圖譜進(jìn)行匹配和比對(duì)分析，并對(duì)蛋白點(diǎn)的定量值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。定量差異≥2倍認(rèn)定為差異蛋白點(diǎn)。

1.2.4 質(zhì)譜鑒定及數(shù)據(jù)庫(kù)搜索［16］

挖取差異蛋白點(diǎn)送往上海博苑生物科技公司蛋白質(zhì)組技術(shù)中心進(jìn)行進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜(MALDI-TOF/TOF MS)分析，獲得的質(zhì)譜分析結(jié)果再利用Mascot在線服務(wù)器(http://www.matrixscience.com/)以美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心GenBank的總蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBInr)進(jìn)行檢索。

2 結(jié)果與討論

2.1 麥曲制曲過(guò)程中水分含量和溫度的變化情況

小麥經(jīng)過(guò)碾碎、加水拌曲、壓制成型、堆曲培養(yǎng)和通風(fēng)干燥之后得到成品麥曲。在麥曲的生產(chǎn)過(guò)程中，工廠主要是通過(guò)控制制曲過(guò)程的麥曲品溫來(lái)控制麥曲的質(zhì)量。制曲過(guò)程中水分、溫度的變化曲線如圖1所示。

圖1 制曲過(guò)程中水分含量和溫度的變化曲線

從圖1中可以看出，小麥經(jīng)過(guò)軋碎拌水成型后，進(jìn)入曲房，及時(shí)的關(guān)窗措施和稻草覆蓋造成相對(duì)封閉的環(huán)境，隨著麥曲水分的逐步揮發(fā)以及麥曲中微生物的生理代謝開(kāi)始活躍，放出大量的熱，于第4天達(dá)到麥曲中最高品溫(55℃)。在這個(gè)高溫下，一些微生物被淘汰，霉菌基本停止生長(zhǎng)，開(kāi)始產(chǎn)生孢子。此后采用開(kāi)窗等降溫措施，麥曲品溫逐漸回落，在曲塊成型堆放的第1周，麥曲品溫一直維持在37℃以上。此后麥曲品溫逐漸降低，在麥曲制作結(jié)束時(shí)，品溫接近室溫。制曲過(guò)程中麥曲中的水分一直在減少，從最初的24.0%降至12.4%左右，這時(shí)麥曲中微生物已完全停止生長(zhǎng)。黃酒麥曲在成型堆放過(guò)程中合適的水分和品溫，為麥曲中微生物的生長(zhǎng)及代謝產(chǎn)酶提供了條件。根據(jù)制曲過(guò)程中麥曲品溫發(fā)生顯著變化時(shí)間點(diǎn)的情況，分別選擇固態(tài)發(fā)酵第1、2、3、4、6及30天的麥曲作為制曲過(guò)程的6個(gè)典型時(shí)期樣品，進(jìn)行麥曲浸提液的宏蛋白質(zhì)組學(xué)研究。

2.2 麥曲制曲過(guò)程中不同時(shí)期浸提液的宏蛋白質(zhì)組樣品的雙向電泳圖譜分析

紹興黃酒麥曲制曲過(guò)程中6個(gè)不同時(shí)期的麥曲浸提液經(jīng)過(guò)TCA-丙酮處理后獲得宏蛋白質(zhì)組樣品，每個(gè)時(shí)期蛋白樣品的上樣量均控制在～550 μg左右，使用長(zhǎng)度為18 cm，pH 3～10非線性的IPG膠條進(jìn)行雙向電泳實(shí)驗(yàn)，獲得了分辨率較高的雙向電泳圖譜(見(jiàn)圖2)。

圖2 紹興黃酒麥曲制曲過(guò)程中不同時(shí)期的雙向電泳圖譜

應(yīng)用PDQuest軟件對(duì)制曲過(guò)程中6個(gè)不同時(shí)期的電泳圖譜進(jìn)行蛋白點(diǎn)檢測(cè)，分別檢測(cè)到了89、102、110、105、97及100個(gè)清晰且重復(fù)度高的蛋白質(zhì)點(diǎn)。對(duì)以上6個(gè)時(shí)期蛋白質(zhì)點(diǎn)的表達(dá)豐度(根據(jù)蛋白質(zhì)點(diǎn)的相對(duì)體積自動(dòng)生成的數(shù)量值)進(jìn)行差異檢測(cè)，共找到12個(gè)差異蛋白點(diǎn)(見(jiàn)圖3及表1)，其中差異蛋白點(diǎn)1－7的局部放大圖見(jiàn)圖4。

圖3 紹興黃酒麥曲成熟期樣品的雙向電泳圖譜上差異蛋白點(diǎn)

圖4 麥曲制曲過(guò)程中不同時(shí)期的雙向電泳圖譜中部分差異蛋白點(diǎn)的放大圖

對(duì)制曲過(guò)程中差異表達(dá)量變化在2倍以上的12個(gè)差異蛋白，按照表達(dá)豐度的變化可分為3類:第1類是隨著制曲過(guò)程，蛋白質(zhì)表達(dá)量逐漸上升(蛋白點(diǎn)編號(hào)為5、7、9和10);第2類是制曲過(guò)程中蛋白表達(dá)量先上升后下降(蛋白點(diǎn)編號(hào)為1、2、3、4、6 和 8);第3類是制曲過(guò)程中蛋白表達(dá)量逐漸降低(蛋白點(diǎn)編號(hào)為11和12)。

表1 制曲過(guò)程中12個(gè)差異蛋白點(diǎn)的表達(dá)豐度值及變化曲線

2.3 差異蛋白點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定結(jié)果

在成熟期樣品的雙向電泳凝膠上挖取這12個(gè)差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析，質(zhì)譜分析所得數(shù)據(jù)通過(guò)Mascot在線軟件，對(duì)NCBI蛋白質(zhì)總庫(kù)進(jìn)行檢索。共有7個(gè)蛋白點(diǎn)鑒定成功，鑒定結(jié)果列于表2。

表2 紹興黃酒麥曲制曲過(guò)程中不同時(shí)期差異蛋白點(diǎn)的MALDI-TOF/TOF MS鑒定結(jié)果

由表2可見(jiàn)，鑒定得到的7種蛋白中來(lái)自微生物的蛋白有4種，分別是來(lái)自地中海擬無(wú)枝菌酸菌產(chǎn)生的凝結(jié)因子5/8型功能蛋白和微單孢菌屬產(chǎn)生的蘋(píng)果酸脫氫酶，以及糖紅孢紅霉菌產(chǎn)生的葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶和羧肽酶前體蛋白。小麥來(lái)源的蛋白有2種，分別是木聚糖酶抑制蛋白I和幾丁質(zhì)酶II。此外還有一種外子藻來(lái)源的功能未知的假定蛋白。

從鑒定結(jié)果來(lái)看，麥曲中存在多種微生物參與各種生物化學(xué)反應(yīng)，這也進(jìn)一步證實(shí)了制曲過(guò)程是多菌種參與發(fā)酵的過(guò)程。其中糖紅孢紅霉菌分泌的葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶主要催化糖酵解中葡萄糖-6-磷酸與果糖-6-磷酸的可逆轉(zhuǎn)化。微單孢菌屬分泌的蘋(píng)果酸脫氫酶，它催化檸檬酸循環(huán)(三羧酸循環(huán))中蘋(píng)果酸與草酰乙酸之間的可逆轉(zhuǎn)換。他們都與丙酮酸、乳酸、蘋(píng)果酸、檸檬酸、琥珀酸等黃酒風(fēng)味物質(zhì)的代謝有著一定的關(guān)系［17］。羧肽酶前體蛋白最終生成羧肽酶，羧肽酶是一類肽鏈端水解酶，作用于肽鏈的游離羧基末端釋放單個(gè)氨基酸，在黃酒發(fā)酵過(guò)程中與酸性蛋白酶共同作用于糯米中的蛋白質(zhì)產(chǎn)生游離的氨基酸，能賦予黃酒特有的風(fēng)味［18］。稀有細(xì)菌地中海擬無(wú)枝菌酸菌分泌的凝結(jié)因子5/8型功能蛋白在細(xì)胞表面識(shí)別、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起著重要作用。

同時(shí)麥曲的浸提液中還存在著小麥相關(guān)的蛋白如木聚糖酶抑制蛋白和幾丁質(zhì)酶等。木聚糖酶抑制劑存在于多種谷物中，如小麥、黑麥、大麥、玉米等。谷物中的木聚糖酶抑制劑僅對(duì)微生物來(lái)源的木聚糖酶有活性，而與植物內(nèi)源性木聚糖酶不發(fā)生作用，因此它們被看作植物防御外來(lái)致病性侵害的屏障［19］小麥種子中包含3類木聚糖酶抑制劑:TAXI、XIP、TLXI。在黃酒麥曲中鑒定出的木聚糖酶抑制劑為TAXI。TAXI僅存在于小麥種子中，它對(duì)真菌和細(xì)菌木聚糖酶均具有抑制作用，但僅限于G/11家族木聚糖［20］。幾丁質(zhì)酶是一類復(fù)合酶，主要水解幾丁質(zhì)多聚體中的β-1，4-糖苷鍵，產(chǎn)生N-乙酰氨基葡萄糖寡聚體，許多微生物、動(dòng)物、植物等都可產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶。高等植物的細(xì)胞中本身不含幾丁質(zhì)，但當(dāng)植物受到真菌、細(xì)菌或病毒等的感染時(shí)，幾丁質(zhì)酶的活性迅速提高。植物產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶大部分為第19族糖基化水解酶類，其功能主要是抑制病原微生物的生長(zhǎng)，進(jìn)行自我防御，是重要的病程相關(guān)蛋白［21－22］。木聚糖酶抑制劑和幾丁質(zhì)酶在麥曲固態(tài)發(fā)酵和黃酒發(fā)酵發(fā)酵過(guò)程中的具體作用，目前還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

以小麥為原料，采用天然的固態(tài)發(fā)酵方式生產(chǎn)麥曲是黃酒釀造中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，麥曲質(zhì)量的好壞對(duì)于黃酒的釀造具有舉足輕重的作用，但目前對(duì)于麥曲在固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中許多機(jī)理性問(wèn)題尚不清楚。本研究中首次借助宏蛋白質(zhì)組學(xué)的理論和方法對(duì)紹興黃酒麥曲制曲過(guò)程中不同時(shí)期的麥曲浸提液進(jìn)行了宏蛋白質(zhì)組學(xué)研究，包括通過(guò)雙向電泳分離宏蛋白質(zhì)組樣品、利用PDQuest軟件分析不同時(shí)期樣品的差異蛋白點(diǎn)以及對(duì)差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析鑒定，所獲得的研究結(jié)果將有助于理解麥曲固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程的機(jī)理。

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