魏愛彬，于潔，王鑫，王宏梅，白娜，張和平

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)教育部乳品生物技術(shù)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古呼和浩特010018)

益生菌是當(dāng)攝入一定量時(shí)可以對(duì)宿主的健康起作用的微生物活體［1］。近20 a來，益生乳酸菌在養(yǎng)殖業(yè)中得到了廣泛的應(yīng)用［2］。益生乳酸菌發(fā)酵全價(jià)飼料具有的諸多優(yōu)點(diǎn)使其得到越來越多的關(guān)注。大量研究證明，益生乳酸菌發(fā)酵過程中與飼料中雜菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)［3］，同時(shí)產(chǎn)生有機(jī)酸(乳酸、乙酸等)降低全價(jià)飼料的pH，產(chǎn)生具有抑菌或殺菌效果的肽抗生素，如細(xì)菌素，從而有效地抑制病原微生物的滋生，減少有害微生物的數(shù)量，并且能生成可以水解細(xì)菌毒素的酶類物質(zhì)［4-5］。益生乳酸菌發(fā)酵后的全價(jià)飼料，具有良好的適口性，同時(shí)益生乳酸菌產(chǎn)生的各種促進(jìn)動(dòng)物消化吸收的活性物質(zhì)，可以顯著地提高飼喂動(dòng)物的生產(chǎn)性能［6-7］。另外，飼料中的益生乳酸菌活菌進(jìn)入動(dòng)物腸道后，使動(dòng)物腸道中有益菌數(shù)量增加，促進(jìn)腸道內(nèi)形成有益優(yōu)勢(shì)菌群，從而競(jìng)爭(zhēng)性抑制病原微生物增殖，保持腸道內(nèi)微生態(tài)平衡，同時(shí)對(duì)機(jī)體的調(diào)節(jié)免疫產(chǎn)生積極影響，提高動(dòng)物的免疫力［8-10］。Lactobacillus casei Zhang(L.casei Zhang)是分離自內(nèi)蒙古地區(qū)傳統(tǒng)酸馬奶中的1株益生菌，經(jīng)16S rDNA同源性分析與GeneBank中標(biāo)準(zhǔn)菌株L.casei ATCC334的同源性為100%［11］。經(jīng)研究表明該菌株具有良好的耐酸性、人工胃腸液耐受性及膽鹽耐受性［12］，可以在小鼠腸道內(nèi)定殖并起到拮抗病原菌的作用［13］，對(duì)小鼠的體液免疫、細(xì)胞免疫和腸黏膜局部免疫具有調(diào)節(jié)作用［14-16］。飼喂該菌體能顯著降低高脂血癥大鼠血清膽固醇和低密度脂蛋白含量［17］，有效提高小鼠血液中的免疫球蛋白G(IgG)及腸道分泌型免疫球蛋白(SIgA)水平，提高小鼠免疫力［18］，其乳酸菌液和發(fā)酵乳對(duì)雛雞免疫功能有促進(jìn)作用［19］。Lactobacillus plantarum P8(L.plantarum P8)篩選自內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳酸菌菌種資源庫(LABCC)的102株植物乳桿菌中。L.plantarum P8在pH 2.5人工胃液中消化3 h，存活率為90.16%;pH 2.0人工胃液中消化3 h，存活率為42.85%，之后進(jìn)入pH 8.0的人工腸液消化12 h，存活率為94.87%。L.plantarum P8在膽鹽濃度為0.3%～1.8%范圍內(nèi)均具有耐受性。動(dòng)物試驗(yàn)證實(shí)L.plantarum P8具有降膽固醇降血脂的功效［20］。本試驗(yàn)研究了以L.casei Zhang、L.plantarum P8單一菌種及復(fù)合菌種發(fā)酵全價(jià)飼料過程中pH及主要微生物類群的變化，為益生乳酸菌進(jìn)一步在全價(jià)飼料中的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試驗(yàn)材料L.casei Zhang和L.plantarum P8直投式發(fā)酵劑由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，其活菌數(shù)分別為11.30 lg cfu/g和11.60 lg cfu/g。140 mm×200 mm真空包裝袋(市售);全價(jià)飼料配方見表1。

表1 全價(jià)飼料組成(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 The composition of complete feed(dry basis)

1.1.2 主要試劑TaKaRa-PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser(大連寶生物RNA反錄純化試劑盒)，TransStart Green qPCR SuperMix(北京全式金熒光定量試劑)，梭狀芽胞桿菌計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基(青島日水生物技術(shù)有限公司)，Potato Dextro Agar培養(yǎng)基(Unipath Ltd)，MRS瓊脂培養(yǎng)基、大腸菌群大腸埃希菌顯色培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)。

1.1.3 主要儀器pH計(jì)(雷磁PHS-3C，上海精密科學(xué)儀器有限公司)，無菌工作臺(tái)(NSC-ⅡA-1200，日本)，Eppendorf 5810高速冷凍離心機(jī)，ND-100微量紫外分光光度計(jì)，AB-Veriti PCR儀，AB-StepOne熒光定量PCR儀。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵全價(jià)飼料的制作向混合均勻的全價(jià)飼料中加入煮沸并冷卻至室溫的自來水，使飼料含水量達(dá)到40%。分別向全價(jià)飼料中接種L.casei Zhang與L.plantarum P8發(fā)酵劑(接種量見表2)，充分混勻。準(zhǔn)確稱取50 g全價(jià)飼料于真空包裝袋中，將包裝袋壓實(shí)以盡量排空空氣，用封口機(jī)將包裝袋封口，25℃發(fā)酵。每組3個(gè)平行，并做空白對(duì)照試驗(yàn)。

表2 L.casei Zhang與L.plantarum P8的接種量Table 2 The inoculation amount of L.casei Zhang and L.plamtarum P8

1.2.2 發(fā)酵全價(jià)飼料pH及活菌數(shù)的測(cè)定全價(jià)飼料25℃發(fā)酵期間，在0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、10 d分別取樣測(cè)定其pH及活菌數(shù)，平行試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。①全價(jià)飼料微生物活菌數(shù)的測(cè)定:從密封袋中準(zhǔn)確稱取10 g全價(jià)飼料樣品于裝有玻璃珠的250 mL滅菌三角瓶中，加入90 g滅菌蒸餾水，置于搖床上160 r/min搖動(dòng)15 min，取0.5 mL稀釋液用0.85%(質(zhì)量體積比)滅菌生理鹽水梯度稀釋至一定倍數(shù)時(shí)，采用各選擇培養(yǎng)基，對(duì)乳酸菌、酵母菌、霉菌、大腸埃希菌、芽胞桿菌、梭狀芽胞桿菌計(jì)數(shù)。其中:乳酸菌的選擇培養(yǎng)，采用MRS瓊脂培養(yǎng)基，平板傾注，30℃厭氧培養(yǎng)48 h;酵母菌和霉菌的選擇培養(yǎng)，采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基(含0.09%的酒石酸)，涂布，30℃培養(yǎng)48 h;大腸埃希菌的選擇培養(yǎng)，采用大腸菌群大腸埃希菌顯色培養(yǎng)基，涂布，30℃培養(yǎng)24 h;在對(duì)好氧細(xì)菌大腸埃希菌、酵母菌、霉菌以及乳酸菌進(jìn)行微生物分析之后，將稀釋液在75℃加熱15 min之后，分別對(duì)芽胞桿菌和梭狀芽胞桿菌進(jìn)行測(cè)定，其中芽胞桿菌采用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，涂布，30℃培養(yǎng)48 h，梭狀芽胞桿菌采用梭狀芽胞桿菌計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，涂布，30℃厭氧培養(yǎng)48 h;②L.casei Zhang和L.plantarum P8活菌數(shù)的測(cè)定:對(duì)L.casei Zhang和L.plantarum P8活菌數(shù)的測(cè)定采用熒光定量PCR技術(shù)(RT-PCR)。a.樣品RNA的提取及cDNA的合成:準(zhǔn)確稱取0.3 g攪拌均勻的全價(jià)飼料移入離心管中，洗滌處理，將洗脫的菌體于1.5 mL離心管中。按照Trizol試劑盒說明書提取樣品RNA，檢測(cè)RNA純度和濃度后，應(yīng)用TaKaRa試劑盒于42℃水浴鍋中恒溫處理2 min去除基因組DNA，以提取純化的總RNA為模板，使用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒，將混勻的反應(yīng)液放置在PCR儀中37℃保溫15 min，而后85℃加熱7 s，最后將反轉(zhuǎn)錄成的cDNA降溫至4℃保藏;b.L.casei Zhang和L.plantarum P8的特異性引物的設(shè)計(jì)及驗(yàn)證:特異性引物的設(shè)計(jì):以L.casei Zhang和L.plantarum P8的全基因組序列為依據(jù)，選取其中一段特異性片段設(shè)計(jì)引物，其中L.casei Zhang的引物序列為L(zhǎng)cZ-F CCGACGTACCAGCTCACT;LcZ-RAAGACTATCAGATAGCGGCTCA。L.plantarum P8的引物序列為L(zhǎng)pP-FACTAACGGGAGGAGTGAT;LpP-R GTCCCGATTTGAGAACTAT。特異性引物的驗(yàn)證:應(yīng)用以上設(shè)計(jì)的特異性引物，擴(kuò)增Lactobacillus casei參考菌株和本實(shí)驗(yàn)室乳酸菌菌種資源庫(LABCC)保藏的240株Lactobacillus casei菌株，同時(shí)擴(kuò)增Lactobacillus plantarum參考菌株和本實(shí)驗(yàn)室乳酸菌菌種資源庫(LABCC)保藏的347株Lactobacillus plantarum菌株，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用這2種特異性引物只能分別擴(kuò)增出L.casei Zhang和L.plantarum P8，因此，引物特異性良好，可以用于后續(xù)L.casei Zhang和L.plantarum P8的定量試驗(yàn);c.標(biāo)準(zhǔn)品的制備和標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:標(biāo)準(zhǔn)品的制備:提取L.casei Zhang和L.plantarum P8的宏基因組DNA，應(yīng)用微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度，根據(jù)已知L.casei Zhang和L.plantarum P8的基因組片段長(zhǎng)度，依據(jù)拷貝數(shù)計(jì)算公式計(jì)算出單位濃度的基因組DNA中所包含的L.casei Zhang和L.plantarum P8的個(gè)數(shù)，將此單位濃度的基因組DNA進(jìn)行10倍系列稀釋并以此作為外標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:以含有梯度稀釋個(gè)數(shù)的L.casei Zhang和L.plantarum P8宏基因組DNA陽性模板的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以PCR反應(yīng)過程中到達(dá)熒光閾值的初始循環(huán)數(shù)(Ct)為縱坐標(biāo)擴(kuò)增得到L.casei Zhang和L.plantarum P8的定量擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線，以此作為待測(cè)樣品中L.casei Zhang和L.plantarum P8數(shù)量測(cè)定的參照標(biāo)準(zhǔn)。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1、2。d.L.casei Zhang和L.plantarum P8活菌數(shù)的測(cè)定:以待測(cè)樣品反轉(zhuǎn)錄的cDNA和標(biāo)準(zhǔn)品為模板，用L.casei Zhang和L.plantarum P8特異性引物進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。反應(yīng)參數(shù):95℃20 s;40個(gè)循環(huán)，95℃5 s，65℃30 s，72℃40 s。將擴(kuò)增結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)曲線比對(duì)計(jì)算出每克樣品中L.casei Zhang和L.plantarum P8的活菌數(shù);③pH的測(cè)定:將取完樣的全價(jià)飼料10倍稀釋液置于磁力攪拌器上攪拌15 min，采用精密pH計(jì)測(cè)量。

圖1 L.casei Zhang的RT-PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The quantitative real-time PCR standard curve of L.casei Zhang

圖2 L.plantarum P8的RT-PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The quantitative real-time PCR standard curve of L.plantarum P8

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS ANOVA 9.0程序進(jìn)行方差分析，P＜0.05，采用origin 7.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 全價(jià)飼料發(fā)酵過程中pH的變化

25℃發(fā)酵過程中，單一菌種和復(fù)合菌種發(fā)酵的全價(jià)飼料樣品pH變化見圖3。與對(duì)照組相比，益生乳酸菌發(fā)酵飼料的pH持續(xù)降低，L.plantarum P8單一菌種發(fā)酵組及復(fù)合菌種發(fā)酵組在發(fā)酵1 d后pH呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)，在發(fā)酵10 d時(shí)pH分別達(dá)到4.24和4.22。L.casei Zhang單一菌種發(fā)酵組則在2 d后呈現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)，在發(fā)酵10 d時(shí)pH為4.23。

圖3 各組在發(fā)酵期間pH變化Fig.3 Changes of pH values in all groups during fermentation

2.2 發(fā)酵全價(jià)飼料發(fā)酵期間及貯藏期間微生物類群的變化

2.2.1 L.casei Zhang和L.plantarum P8的活菌數(shù)量變化試驗(yàn)組中乳酸菌活菌數(shù)的變化結(jié)果見圖4。發(fā)酵期間，乳酸菌的活菌數(shù)逐漸升高。采用平板計(jì)數(shù)法對(duì)發(fā)酵飼料中的乳酸菌總數(shù)進(jìn)行測(cè)定，乳酸菌總數(shù)結(jié)果顯示，發(fā)酵組中乳酸菌總數(shù)持續(xù)增長(zhǎng)，其中L.casei Zhang、L.plantarum P8單一菌種發(fā)酵組和復(fù)合菌種發(fā)酵組中的乳酸菌總數(shù)分別在發(fā)酵6、4、6 d達(dá)到最大值，分別為9.94、9.83和9.84 lg cfu/g。之后各發(fā)酵組中乳酸菌總數(shù)下降。同時(shí)應(yīng)用RT-PCR技術(shù)對(duì)單一菌種及復(fù)合菌種發(fā)酵組中L.casei Zhang，L.plantarum P8活菌數(shù)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，L.casei Zhang、L.plantarum P8單一菌種發(fā)酵組在發(fā)酵3 d時(shí)達(dá)到最大值，分別為9.14和9.18 lg cfu/g，復(fù)合菌種發(fā)酵組中的L.casei Zhang、L.plantarum P8分別在發(fā)酵4和2 d時(shí)活菌數(shù)最高，為8.17和9.31 lg cfu/g。后續(xù)發(fā)酵過程中，L.casei Zhang、L.plantarum P8單一菌種發(fā)酵組和復(fù)合菌種發(fā)酵組中的L.plantarum P8活菌數(shù)變化不明顯，發(fā)酵10 d時(shí)活菌數(shù)分別是8.91、8.89和8.69 lg cfu/g。復(fù)合菌種發(fā)酵組中的L.casei Zhang在貯藏期間持續(xù)降低，發(fā)酵10 d時(shí)為6.58 lg cfu/g。其中L.plantarum P8單一菌種發(fā)酵組和復(fù)合菌種發(fā)酵組中的L.plantarum P8活菌數(shù)差異不顯著(P＞0.05)。

表3 各組在發(fā)酵期間乳酸菌活菌數(shù)的變化Table 3 Changes of Lactobacillus counts in all groups during fermentation

2.2.2 酵母菌的數(shù)量變化益生乳酸菌發(fā)酵的全價(jià)飼料中酵母菌活菌數(shù)逐漸減少，在發(fā)酵10 d時(shí)最低，L.casei Zhang、L.plantarum P8單一菌種及復(fù)合菌種發(fā)酵組中的酵母菌活菌數(shù)分別是3.74、3.65和3.72 lg cfu/g，顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)。

2.2.3 霉菌的數(shù)量變化發(fā)酵結(jié)束時(shí)，益生乳酸菌發(fā)酵飼料中霉菌未被檢出。發(fā)酵4 d時(shí)，沒有檢測(cè)到L.plantarum P8單一菌種發(fā)酵組及復(fù)合菌種發(fā)酵組中的霉菌，此時(shí)L.casei Zhang單一菌種發(fā)酵組和對(duì)照組中霉菌活菌數(shù)分別為3.84和4.89 lg cfu/g。發(fā)酵6 d時(shí)，沒有檢測(cè)到L.casei Zhang單一菌種發(fā)酵組中的霉菌，對(duì)照組中霉菌在發(fā)酵6和10 d時(shí)的活菌數(shù)分別為5.01和4.77 lg cfu/g。

圖4 各組在發(fā)酵期間酵母菌活菌數(shù)的變化Fig.4 Changes of yeasts counts in all groups during fermentation

圖5 各組在發(fā)酵期間霉菌活菌數(shù)的變化Fig.5 Change of Mold counts in all groups during fermentation

2.2.4 大腸菌群的數(shù)量變化全價(jià)飼料發(fā)酵過程中的大腸菌群的活菌數(shù)變化見圖7。相比對(duì)照組，益生乳酸菌發(fā)酵飼料中的大腸菌群活菌數(shù)下降趨勢(shì)顯著(P＜0.05)，發(fā)酵10 d時(shí)，益生乳酸菌發(fā)酵的全價(jià)飼料中的大腸菌群未被檢出，此時(shí)對(duì)照組中的大腸菌群活菌數(shù)處于較高的水平，為7.82 lg cfu/g。

圖6 各組在發(fā)酵期間大腸菌群活菌數(shù)的變化Fig.6 Changes of Coliform bacteria counts in all groups during fermentation

2.2.5 芽胞桿菌的數(shù)量變化益生乳酸菌發(fā)酵飼料中的芽胞桿菌活菌數(shù)在飼料中呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，L.casei Zhang、L.plantarum P8單一菌種發(fā)酵組及復(fù)合菌種發(fā)酵組中芽胞桿菌活菌數(shù)分別在發(fā)酵2.5、1.5和1 d時(shí)出現(xiàn)最大值，為6.47、5.78和5.64 lg cfu/g，之后持續(xù)下降。發(fā)酵10 d時(shí)，L.casei Zhang、L.plantarum P8單一菌種發(fā)酵組及復(fù)合菌種發(fā)酵組的芽胞桿菌活菌數(shù)分別是2.71、2.69和2.41 lg cfu/g，顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)。

圖7 各組在發(fā)酵期間芽胞桿菌活菌數(shù)的變化Fig.7 Changes of Bacilli bacteria counts in all groups during fermentation

2.2.6 梭狀芽胞桿菌的數(shù)量變化各發(fā)酵組在發(fā)酵期間梭狀芽胞桿菌活菌數(shù)在1.30～3.30 lg cfu/g范圍內(nèi)波動(dòng)變化，發(fā)酵組中梭狀芽胞桿菌活菌數(shù)顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)。發(fā)酵10 d時(shí)，L.casei Zhang、L.plantarum P8單一菌種發(fā)酵組中的梭狀芽胞桿菌未被檢出，復(fù)合菌種發(fā)酵組和對(duì)照組中梭狀芽胞桿菌活菌數(shù)分別為1.47和2.15 lg cfu/g。

圖8 各組在發(fā)酵期間梭狀芽胞桿菌活菌數(shù)的變化Fig.8 Changes of Clostridum counts in all groups during fermentation

3 討論

3.1 添加L.casei Zhang和L.plantarum P8對(duì)全價(jià)飼料pH的影響

在全價(jià)飼料中添加L.casei Zhang和L.plantarum P8能夠明顯降低飼料的pH。其中L.casei Zhang單一菌種發(fā)酵全價(jià)飼料在發(fā)酵0～2 d時(shí)pH降低緩慢，這是由于L.casei Zhang蛋白水解能力較弱，菌株生長(zhǎng)速度緩慢導(dǎo)致的。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)復(fù)合菌種發(fā)酵全價(jià)飼料pH低于單一菌種發(fā)酵飼料，說明L.casei Zhang與L.plantarum P8復(fù)合發(fā)酵彼此有較好的促進(jìn)作用。

3.2 添加L.casei Zhang和L.plantarum P8對(duì)全價(jià)飼料微生物類群的影響

飼料中的雜菌對(duì)飼料的發(fā)酵品質(zhì)有較大的影響，其中飼料中的酵母菌某些種能引起飼料變質(zhì)，少數(shù)種屬于病原菌，其強(qiáng)烈的活動(dòng)會(huì)帶來很嚴(yán)重的后果;霉菌是導(dǎo)致飼料好氣性變質(zhì)的微生物之一，同時(shí)還分解飼料中的糖分及乳酸;大腸菌群可使飼料異常發(fā)酵導(dǎo)致飼料變質(zhì);芽胞桿菌分解飼料中的蛋白和脂肪，產(chǎn)生腐敗氣味，降低飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，影響飼料品質(zhì);梭狀芽胞桿菌為嚴(yán)格厭氧菌，如果控制不當(dāng)，將產(chǎn)生外毒素，致動(dòng)物發(fā)病。

添加益生乳酸菌對(duì)全價(jià)飼料中的酵母菌、大腸菌群、霉菌、芽胞桿菌和梭狀芽胞桿菌有良好的抑制效果。發(fā)酵初期，添加的益生乳酸菌和飼料中微生物的開始大量增殖，消耗了飼料環(huán)境中的少量氧氣，使飼料中的厭氧程度逐漸增強(qiáng)，促進(jìn)了乳酸菌的生長(zhǎng)，對(duì)其中的好氧細(xì)菌有抑制作用。同時(shí)發(fā)酵組中的乳酸菌在發(fā)酵2.5 d左右達(dá)到9.00 lg cfu/g以上，在飼料中形成絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)，乳酸菌的代謝過程中產(chǎn)生大量的酸性物質(zhì)，使發(fā)酵組在發(fā)酵3 d左右pH達(dá)到5.0以下，有效地抑制了飼料中不耐酸的雜菌如梭狀芽胞桿菌、霉菌、大腸菌群的生長(zhǎng)，并且由于乳酸菌的優(yōu)勢(shì)菌群地位，與酵母菌爭(zhēng)奪飼料中糖分的過程中［21］，抑制酵母菌的增殖。益生乳酸菌在代謝過程中產(chǎn)生的一些抑菌物質(zhì)(如乳酸、過氧化氫、乙醛等)，較好地抑制甚至殺滅了飼料中的雜菌。Elferink等［22］研究證實(shí)了這一點(diǎn)。蔡義民［23］的研究證實(shí)，在飼料中添加乳酸菌能夠有效地抑制霉菌、酵母菌和一般細(xì)菌的繁殖。L.casei Zhang單一菌種發(fā)酵組中雜菌活菌數(shù)高于另外2個(gè)發(fā)酵組，這可能是由于L.casei Zhang單菌發(fā)酵蛋白水解能力較弱，發(fā)酵初期菌株生長(zhǎng)緩慢導(dǎo)致的［24］。對(duì)照組對(duì)飼料中酵母菌、大腸菌群、霉菌、芽胞桿菌和梭狀芽胞桿菌抑制作用不顯著，這可能是由于全價(jià)飼料中固有的乳酸菌產(chǎn)酸能力弱造成的［25］，pH的變化情況也較好地說明了這一點(diǎn)。

酵母菌菌體中含有非常豐富的蛋白質(zhì)、B族維生素、脂肪、糖、酶等多種營(yíng)養(yǎng)成分。大量的應(yīng)用研究試驗(yàn)證明，酵母在提高動(dòng)物免疫力、提高動(dòng)物生產(chǎn)性能和減少應(yīng)激等方面均起作用［26-27］。所以，在評(píng)價(jià)發(fā)酵飼料的質(zhì)量時(shí)，不能簡(jiǎn)單地認(rèn)為酵母菌越少越好。

總之，在全價(jià)飼料中接種的L.casei Zhang和L.plantarum P8能夠快速增殖并達(dá)到一定的數(shù)量，其發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量酸性物質(zhì)，快速降低了飼料的pH，從而有效抑制飼料中雜菌的增殖，保證飼料的質(zhì)量。在接種的益生乳酸菌活菌數(shù)達(dá)到最大值后，繼續(xù)發(fā)酵過程中單一菌種發(fā)酵和復(fù)合菌種發(fā)酵的全價(jià)飼料中的益生乳酸菌呈現(xiàn)了較好的穩(wěn)定性，這對(duì)飼料的長(zhǎng)時(shí)間保藏是非常有利的。

本文采用益生菌L.casei Zhang和L.plantarum P8單一菌種及復(fù)合菌種發(fā)酵全價(jià)飼料，通過對(duì)發(fā)酵過程中全價(jià)飼料的pH及微生物類群的變化，研究2株益生菌在發(fā)酵全價(jià)飼料中的應(yīng)用。添加了益生乳酸菌的全價(jià)飼料，其pH降低較快，能夠很好地抑制全價(jià)飼料中其他雜菌甚至有害菌的增長(zhǎng)，長(zhǎng)時(shí)間發(fā)酵過程中具有良好的穩(wěn)定性，保證全價(jià)飼料具有良好的品質(zhì)。研究表明，L.casei Zhang和L.plantarum P8具有發(fā)酵優(yōu)質(zhì)全價(jià)飼料的潛力。

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