張 倩，尹忠鵬，趙海南，龐曉晨，馬 麗，郭 林，劉志東，王 紅

微滲析技術用于金黃膏在大鼠體內(nèi)經(jīng)皮滲透性的初步研究*

張 倩，尹忠鵬，趙海南，龐曉晨，馬 麗，郭 林，劉志東，王 紅

[目的]研究金黃膏在大鼠體內(nèi)的經(jīng)皮滲透性。[方法]應用經(jīng)皮微滲析在體取樣技術，以Wistar大鼠為模型動物進行實驗。微滲析探針的在體回收率采用反向滲析法測定。[結(jié)果]反向滲析法測定的在體回收率為（32．81±1．33）%。滲析液中的藥物穩(wěn)態(tài)流量（Js）為2．73 ng/h，滯后時間（Tlag）為1．50 h。[結(jié)論]金黃膏中的有效成分在皮膚內(nèi)有一定的滯留量，該制劑適合經(jīng)皮給藥。

經(jīng)皮微滲析；鹽酸小檗堿；經(jīng)皮吸收；高效液相色譜法

將微滲析在體取樣技術應用于藥物的經(jīng)皮吸收研究中，稱之為經(jīng)皮微滲析（cutaneous microdialysis）[1-4]。此技術直到 1991年 Anderson等[5]對微滲析探針進行改進，并研究了人體對乙醇的經(jīng)皮吸收，才開始了真正意義上的經(jīng)皮微滲析，此后這項技術發(fā)展非常迅速，為該領域的研究提供了一種新方法。對實驗動物皮膚組織進行在體、連續(xù)的藥物濃度監(jiān)測，是經(jīng)皮微滲析技術的重要特點，為在體研究外用制劑的經(jīng)皮吸收動力學和生物等效性提供了有效的方法，微滲析技術在透皮給藥方面已得到廣泛應用。

金黃膏是一種良好的治療瘡毒紅腫疼痛等疾病的中藥復方膏劑，外敷能達到清熱除濕、解毒消腫、散瘀止痛的效果[6]。其主要由姜黃、白芷、大黃、黃柏、天南星、厚樸、陳皮等10味中藥組成。由于小檗堿為該膏劑主藥黃柏中含量較高的成分，含量可達總生物堿的85%以上[7]，故本實驗以小檗堿為檢測指標來研究藥物在動物體內(nèi)動態(tài)變化的規(guī)律及特點。

1 材料與儀器

金黃膏（由天津中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院制劑室提供）；鹽酸小檗堿標準品（中國藥品生物制品檢定所，批號110713-200609）；乙腈（天津市康科德科技有限公司，色譜純）；磷酸二氫鉀（天津市光復科技發(fā)展有限公司，分析純）；磷酸（天津市北方天醫(yī)化學試劑廠，分析純）；烏拉坦（天津市光復精細化工研究所，分析純）。Wistar大鼠,雌雄兼用，體質(zhì)量200~250 g，天津?qū)嶒瀯游镏行奶峁细褡C號：SCXK（津）2010-0002。CMA-102型微量泵控制器（CMA公司，瑞典）；LM-10線型微滲析探針（Bioanalytical systems，美國）；SPD-10Avp島津高效液相色譜儀（日本Shmadzu公司）；AX205電子天平（瑞士Mettleb Toledo公司）；BP121S電子天平（德國Sartorius公司）。

2 實驗方法

2.1 色譜條件 參照文獻[8]，采用高效液相色譜法（HPLC）測定。色譜柱為Diamond DIKMA ODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈：磷酸鹽緩沖液（5%磷酸調(diào) pH 至3.0）=30∶70，流速為 1.0mL/min，柱溫為30℃，檢測波長為346 nm，進樣量20 μL。

2.2 探針的植入 取Wistar大鼠，用20%烏拉坦腹腔注射麻醉（5 mL/kg，腹腔注射），剃除腹部鼠毛，仰位固定于鼠板上。將探針植入大鼠真皮中，滲析窗置于所要采樣的部位。用組織膠將探針入口及出口位置固定。大鼠周圍環(huán)境溫度控制在37~39℃[9]。

2.3 在體回收率的測定 微滲析探針植入大鼠體內(nèi)后，用去離子水作為灌注液，沖洗探針1.5 h。在1.5 h的沖洗期內(nèi)，由于探針的植入而引起的皮膚局部充血、紅腫和皮膚短期增厚可以消除或減少。有文獻[10]報道在無毛大鼠活體皮膚內(nèi)植入微滲析探針30 min后，皮膚血流以及組胺水平即可以恢復到正常值，因此主張微滲析實驗至少在探針植入30 min后才能開始進行。

沖洗期過后，依次用 414、621、828、1 040、2 070 ng/mL的鹽酸小檗堿溶液為灌注液，流速設定為5.0 μL/min，更換灌注液后，在收集下一個樣品之前，至少有1 h的沖洗期。每間隔30 min收集1次進樣，取2次平均值。以滲析液和灌注液中藥物的濃度差為縱坐標，對灌注液中藥物濃度作圖，所得直線的斜率即為探針的回收率。直線的斜率以最小2乘法求得。

2.4 金黃膏大鼠在體經(jīng)皮微滲析實驗 沖洗期過后，將金黃膏樣品約3 cm2，貼于大鼠腹部剪毛區(qū)，使得探針的滲析窗剛好位于貼片的正下方，給藥9h。于 0~1、1~2、2~3、3~4、4~5、5~6、6~7、7~8、8~9 h 間收集滲析液樣品，注入HPLC系統(tǒng)進行測定。

3 結(jié)果與討論

3.1 在體回收率的測定 參照文獻[11]，微滲析探針中灌注液的連續(xù)流動導致了藥物在組織液和灌注液之間的擴散不能完全達到平衡，藥物在滲析液中的濃度和在組織液中的濃度并不相等。相對回收率是指在滲析液中的濃度（Cd）和在組織液中的濃度（Cm）的比值，其定義式為：

以Cd-Cp對Cp作圖，所得直線的斜率即為探針的回收率R，橫軸上的截距為Cm。

根據(jù)相對回收率的定義式，以滲析液與灌注液中小檗堿的濃度差（Cd-Cp）對灌注液中的藥物濃度（Cp）作圖，得到線性方程:Cd-Cp=-0.328 1Cp-45.759（r=0.992 5），表明有良好的線性關系，該方程計算的回收率為（32.81±1.33）%。

3.2 在體經(jīng)皮微滲析實驗 以金黃膏連續(xù)給藥9 h，測定滲析液中藥物濃度，圖1是以滲析液中藥物的

式中Cp為灌注液中的藥物濃度。如果Cp=0，即滲析探針中灌注的是空白人工生理溶液 (灌注液)，則公式-1可以改寫為：濃度對取樣時間間隔的中間點作圖得到的圖線，圖2是滲析液中藥物的累積量對時間作圖得到的圖線，對圖線中的直線部分進行回歸,得到Q-t方程：Q＝2．7323t－1．505 6（r＝0．999 6），直線的斜率為滲析液中的藥物透皮吸收的穩(wěn)態(tài)流量（Js），即2.73 ng/h；直線與時間軸的交點為滯后時間（Tlag），即1.50 h。

以上藥物的濃度-時間曲線是在時間上連續(xù)的藥物濃度監(jiān)測圖，真實的記錄了藥物濃度在整個監(jiān)測時間范圍內(nèi)的連續(xù)變化波動情況。藥物的累積透過量時間曲線也表明了藥物在皮膚內(nèi)有一定的滯留量。在實驗過程中，滲析液中測得的藥物實際上是在一定的取樣時間段內(nèi)的蓄積量，即最終測得的濃度為取樣時間段內(nèi)的平均濃度。

微滲析技術對組織中藥物的連續(xù)的、不間斷的監(jiān)測，使實驗數(shù)據(jù)更接近真實值，更加具有說服力，為評價藥物療效提供了十分重要的實驗數(shù)據(jù)。

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Preliminary study on permeability of Jinhuanggao by transcutaneous microdialysis in rats in vitro

ZHANG Qian1,YIN Zhong-peng1,ZHAO Hai-nan1,PANG Xiao-chen1,MA Li1,GUO Lin2,LIU Zhi-dong1,WANG Hong2
（1．Tianjin Modern Chinese Medicine Key Laboratory-Province and Ministry Co-established State Key Laboratory Cultivation Base,Tianjin 300193,China;2.Second Affiliated Hospital of Tianjin University of TCM,Tianjin 300150,China）

[Objective]To study the transcutaneous absorption of Jinhuanggao in rats.[Methods]An in vivo sampling technique and transcutaneous microdialysis were used to determine the drug concentration in dermis in rats.The recovery of the microdialysis probe was adopted to assess in vivo according to the retrodialysis method.[Results]The recovery in vivo was (32.81±1.33)%by retrodialysis method.The steady state flux of berberine hydrochloride in dialysate was 2.73 ng/h,and the lag time was 1.5 h.[Conclusion]The active ingredient in Jinhuanggao has a good retention amount under the skin.So this preparation is suitable for transdermal drug delivery.

cutaneous microdialysis;berberine hydrochloride;transdermal delivery;HPLC

R284

A

1673－9043（2012）03－0151-03

國家自然基金項目（81072818）。

300193 天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地（張 倩，尹忠鵬，趙海南，龐曉晨，馬 麗，劉志東）300150 天津中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院（郭 林，王 紅）

張 倩（1987-），女，碩士研究生，主要從事緩控釋制劑的研究。

*通訊作者：劉志東，王 紅。

2012-05-13）