毛 璞， 邱桂霞， 葉 丹， 劉曉青， 黎毅敏，

重癥監(jiān)護(hù)病房碳青霉烯類抗生素耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥機(jī)制及同源性分析

毛 璞， 邱桂霞＊， 葉 丹， 劉曉青＊＊， 黎毅敏＊，＊＊

目的分析耐碳青霉烯類抗生素鮑曼不動(dòng)桿菌基因型，進(jìn)行同源性分析，探討碳青霉烯類抗生素耐藥率升高的原因。方法應(yīng)用WHONET 5.0分析廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)病房（ICU）分離的鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥率變化。收集2008年1月至2009年12月ICU碳青霉烯類抗生素耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌35株，應(yīng)用VITEK-2全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀進(jìn)行菌株鑒定，采用K-B紙片擴(kuò)散法測(cè)定15種抗菌藥物的敏感性，PCR檢測(cè)金屬β內(nèi)酰胺酶及碳青霉烯酶OXA基因，脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）分析同源性。結(jié)果該院分離的鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類抗生素的耐藥率顯著增加，對(duì)美羅培南的耐藥率從10.8%升高到62.3%，對(duì)亞胺培南的耐藥率從13.5%升高到58.8%。PFGE分析存在8個(gè)克??；blaOXA-51、blaOXA-23、blaOXA-58陽(yáng)性的分別為33株（94.3%）、20株（57.1%）和6株（17.1%）。ISAba1相關(guān)blaOXA-23是碳青霉烯酶主要的存在形式。未檢測(cè)到金屬β內(nèi)酰胺酶。結(jié)論該院ICU分離的鮑曼不動(dòng)桿菌OXA-23型碳青霉烯酶基因檢出率最高，并存在交叉感染的情況，應(yīng)引起臨床重視。

鮑曼不動(dòng)桿菌； 碳青霉烯酶； 脈沖場(chǎng)凝膠電泳

鮑曼不動(dòng)桿菌已成為引起醫(yī)院感染的最主要的細(xì)菌之一［1-2］。對(duì)產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶（extendedspectrumβ-lactamases，ESBLs）、Amp Cβ內(nèi)酰胺酶（AmpCβ-lactamases，AmpC酶）的鮑曼不動(dòng)桿菌引起的重癥感染，碳青霉烯類抗生素是最后一道防線。碳青霉烯類抗生素耐藥的分子機(jī)制主要由于外源性獲得碳青霉烯酶，主要分為B類和D類酶。B類酶又 稱 為 金 屬 β 內(nèi) 酰 胺 酶 （metallo-β-lactamases，MBLs），目前鮑曼不動(dòng)桿菌中已被鑒別出來(lái)的獲得性MBLs有IMP、VIM型酶等。D類酶為苯唑西林酶（OXA型酶），在鮑曼不動(dòng)桿菌中常見(jiàn)有blaOXA-23、blaOXA-24、blaOXA-51、blaOXA-58［3］。此 外，常 見(jiàn)插入序列ISAba1位于OXA基因前增強(qiáng)其表達(dá)［4］。

2008—2009年間，我院重癥監(jiān)護(hù)病房（ICU）分離的鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥率明顯升高。本研究主要通過(guò)對(duì) MBLs、OXA、ISAba1等基因的檢測(cè)，分析該菌對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥的變化，從而探討其對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥機(jī)制。

材料與方法

一、材料

（一）菌株來(lái)源 2008年1月至2009年12月，我院ICU住院患者痰標(biāo)本臨床分離株，非重復(fù)臨床分離的碳青霉烯類抗生素耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌（carbapenem-resistantAcinetobacterbaumannii，CRAB）35株。

（二）儀器與試劑 PCR擴(kuò)增儀（Bio-rad公司1000），凝膠成像系統(tǒng)（Bio-rad公司）。所用引物均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。PCR試劑購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。New England Biolabs限制性內(nèi)切酶ApaⅠ。

二、方法

（一）菌株鑒定及藥敏試驗(yàn) 使用VITEK-2微生物自動(dòng)檢測(cè)儀鑒定菌種。采用K-B紙片擴(kuò)散法測(cè)定鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)哌拉西林、哌拉西林-他唑巴坦、替卡西林-克拉維酸、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢吡肟、頭孢曲松、亞胺培南、美羅培南、阿米卡星、慶大霉素、米諾環(huán)素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星和甲氧芐啶-磺胺甲口惡唑等15種抗菌藥物的敏感性，以大腸埃希菌ATCC 25922、銅綠假單胞菌ATCC 27853和金葡菌ATCC 25923為質(zhì)控菌株，結(jié)果判定參照CLSI 2009年標(biāo)準(zhǔn)。

（二）脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE） 分離株接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過(guò)液。離心收集40 μLA540的菌液，20μL 1×TE重懸，加入等體積的2%cleancut agarose（Bio-rad，USA）。立即混勻后加入模具，制成膠塊。將膠塊放入300μL的細(xì)胞裂解液（100 mmol／L Tris、100 mmol／L EDTA），加入20 mg／m L的蛋白酶K 5μL 50℃浴過(guò)夜。去掉細(xì)胞裂解液，加入800μL 1×TE洗3次，每次1 h。0.1×TE 800μL洗1 h。繼續(xù)酶切或放4℃保存?zhèn)溆?。每塊小膠加50 u ApaⅠ（NEB，USA）內(nèi)切酶，25℃過(guò)夜。CHEF-DR Ⅲ脈沖場(chǎng)電泳儀（Bio-rad，USA），0.5×TBE，1%Pulsed Field Certified Agarose（Bio-rad），14℃，6V／cm，角度變換120°，線性，轉(zhuǎn)換時(shí)間為0.5～20 s，時(shí)間20 h。電流結(jié)束后，EB染色后成像。

應(yīng)用Bio Numerics軟件行圖像分析，選擇UPGMA（unweighted pair group method using arithmetic averages）方法，條帶位置差異容許度1%，優(yōu)化值0.5%，相似度≥80%為同一亞型，代表同一克隆株；＜80%者為不同的基因型，代表不同的克隆株［5］。

（三）PCR檢測(cè) 應(yīng)用煮沸法粗制細(xì)菌DNA模版。PCR 檢 測(cè)blaIMP-1、blaIMP-2、blaVIM-1、blaVIM-2、blaOXA-23、blaOXA-24、blaOXA-51、blaOXA-58基 因，各 基 因 引物序列、目的產(chǎn)物長(zhǎng)度和退火溫度見(jiàn)表1。PCR體系總體積50μL，10×緩沖液 5μL，d NTPs 200μmol／L，上下游引物各400 nmol／L，Taq聚合酶1.25 u，DNA模板1μL。擴(kuò)增產(chǎn)物取5μL進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，90 V，30 min。EB染色后成像。PCR產(chǎn)物送上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

結(jié) 果

一、藥敏試驗(yàn)結(jié)果

應(yīng)用WHONET5.4分析2008年1月至2009年12月ICU分離鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥率，碳青霉烯類抗生素的耐藥率顯著增加，對(duì)美羅培南的耐藥率從10.8%增加至62.3%，對(duì)亞胺培南的耐藥率從13.5%增加至58.8%（圖1）。

二、碳青霉烯酶基因及插入序列檢測(cè)

2008年1月至2009年12月，我院重癥監(jiān)護(hù)病房住院患者痰標(biāo)本臨床分離非重復(fù)CRAB共51株，由于屬于回顧性分析，將其中隨機(jī)凍存的35株進(jìn)一步分析。

在35 株 CRAB 中，blaOXA-51、blaOXA-23、blaOXA-58陽(yáng)性的分別為33株（94.3%）、20株（57.1%）和6株（17.1%）。同時(shí)攜帶blaOXA-51和blaOXA-23菌株有20株（57.1%）；同時(shí)攜帶blaOXA-51和blaOXA-58的菌株有 6 株 （17.14%）。 未 檢 測(cè) 出blaOXA-24、blaIMP-1、blaIMP-2、blaVIM-1、blaVIM-2基 因。攜 帶 有blaOXA-23的 菌株上游檢測(cè)均檢測(cè)到插入序列ISAba1，5株菌株blaOXA-51上游檢測(cè)到ISAba1，1株菌株blaOXA-58上游檢測(cè)到ISAba1。

表1 碳青霉烯酶基因及插入序列PCR引物Table1.Primers and insert sequences used in polymerase chain reaction to detect carbapenemase genes

圖1 2008年至2009年鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥率變化FIG.1.Changing pattern of antibiotic resistance in the A.baumannii strains isolated during the period from 2008 through 2009

三、PFGE同源性分析

采用PFGE對(duì)CRAB進(jìn)行同源性分析，結(jié)果顯示共存在8個(gè)克隆，克隆A包括2110、1566菌株，克隆B包括4006、3038菌株，克隆C包括4128、2544、4358菌株，克隆 D包括3605、2772、3334，克隆 E包括3693、3325，克隆F包括685、4492，克隆G包括4026、4405，克隆H包括433、1239（見(jiàn)圖2）。上述結(jié)果提示在研究期間存在6次交叉感染（分別涉及2例患者）；存在2次小規(guī)模流行，分別涉及3例患者。51.4%（18／35）分離出CRAB的患者發(fā)生了交叉感染。

討 論

近年來(lái)，鮑曼不動(dòng)桿菌在全球的擴(kuò)散引起了極大的關(guān)注。自1985年碳青霉烯類抗生素應(yīng)用于臨床，該菌對(duì)其耐藥率逐年增加。對(duì)CRAB大多數(shù)為多重耐藥菌，因此對(duì)住院患者造成的威脅也逐年增大。另由于ICU患者病情重，侵襲性操作多，成為多重耐藥細(xì)菌滋生傳播的主要場(chǎng)所［6］。因此，本研究對(duì)ICU臨床分離CRAB進(jìn)行耐藥趨勢(shì)、同源性及耐藥分子特征分析，研究鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥的變化與 MBLs、OXA、ISAba1的相關(guān)性，探討鮑曼不動(dòng)桿菌迅速擴(kuò)散的原因。

圖2 PFGE圖譜及系統(tǒng)樹(shù)狀圖FIG.2.PFGE profiles of Apa-I digested genomic DNA of 35 carbapenem-resistant A.baumannii strains isolated from ICU patients

OXA-23是鮑曼不動(dòng)桿菌中最早報(bào)道的OXA型碳青霉烯酶［7］。本研究結(jié)果顯示本組CRAB OXA-23的攜帶率為57.1%，為主要分布的碳青霉烯酶，此陽(yáng)性率明顯低于其他醫(yī)院或地區(qū)的報(bào)道；本研究中OXA-58的陽(yáng)性率為17.1%，卻明顯高于其他醫(yī)院或地區(qū)的報(bào)道。沈萍等［8］報(bào)道2005年浙江地區(qū)CRAB的OXA-23陽(yáng)性率已經(jīng)高達(dá)94.15%（322／342），無(wú) OXA-58的檢測(cè)出；四川大學(xué)華西醫(yī)院2006至2009年ICU CRAB的OXA-23陽(yáng)性率已經(jīng)高達(dá) 99.0% （98／97），OXA-58 陽(yáng)性率 僅 為1%［9］；全國(guó)12所三級(jí)甲等醫(yī)院2007年7月至2008年6月 CRAB 的 OXA-23陽(yáng)性率為80.4%（78／97），OXA-58陽(yáng)性率僅為2.1%［10］。此期間內(nèi)廣州地區(qū)相關(guān)研究鮮有報(bào)道。因此我們推測(cè)可能由于地域、科室等不同，存在不同的流行菌株，造成了OXA-23、OXA-58陽(yáng)性率的差異。盡管 OXA-23、OXA-58陽(yáng)性率在上述報(bào)道中各有高低，但OXA-23均為鮑曼不動(dòng)桿菌中主要分布碳青霉烯酶的型。

35株CRAB中33株菌攜帶OXA-51基因，僅有5株菌的上游存在ISAba1，6株OXA-58陽(yáng)性菌株中1株菌上游檢測(cè)到ISAba1，20株OXA-23陽(yáng)性菌株上游均檢測(cè)到ISAba1。上述結(jié)果表明在我院分離的CRAB中ISAba1主要位于OXA-23的上游。

同時(shí)攜帶OXA-51和OXA-23的20株菌中，ISAba1均位于OXA-23的上游；同時(shí)攜帶blaOXA-51和blaOXA-58的菌株有6株（17.1%），僅有1株菌的OXA-58上游存在ISAba1，其余菌株blaOXA-51和blaOXA-58上游均未檢測(cè)到ISAba1。當(dāng)OXA-23與 OXA-51或 OXA-58同時(shí)存在，ISAba1傾向插入OXA-23的上游。因此，我們推測(cè)，菌株一旦外源獲得OXA-23基因，ISAba1從其他位置轉(zhuǎn)移優(yōu)先插入至OXA-23的上游。

本研究中，2株菌沒(méi)有檢測(cè)出鮑曼不動(dòng)桿菌固有耐藥基因OXA-51，我們推測(cè)這2株菌可能不是鮑曼不動(dòng)桿菌，而屬于其他不動(dòng)桿菌；或可能OXA-51的基因發(fā)生變異，PCR無(wú)法檢測(cè)。

［1］ 文細(xì)毛，任南，吳安華.2010年全國(guó)醫(yī)院感染橫斷面調(diào)查感染病例病原分布及其耐藥性［J］.中國(guó)醫(yī)院感染控制雜志，2012，11（1）：1-6.

［2］ 楊啟文，王輝，徐英春，等.2009年中國(guó)13家教學(xué)醫(yī)院院內(nèi)感染病原菌的抗生素耐藥性監(jiān)測(cè)［J］.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2011，34（5）：422-430.

［3］ Brown S，Amyes S.OXA （beta）-lactamases in Acinetobacter：the story so far［J］.J Antimicrob Chemother，2006，57（1）：1-3.

［4］ Turton JF，Ward ME，Woodford N，et al.The role of ISA-ba1 in expression of OXA carbapenemase genes in Acinetobacter baumannii［J］.FEMS Microbiol Lett，2006，258（1）：72-77.

［5］ Tenover FC，Arbeit RD，Goering RV，et al.Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsedfield gel electrophoresis：criteria for bacterial strain typing［J］.J Clin Microbiol，1995，33（9）：2233-2239.

［6］ Dijkshoorn L，Nemec A，Seifert H.An increasing threat in hospitals：multidrug-resistantAcinetobacterbaumannii［J］.Nat Rev Microbiol，2007，5（12）：939-951.

［7］ Donald HM，Scaife W，Amyes SG，et al.Sequence analysis of ARI-1，a novel OXA beta-lactamase，responsible for imipenem resistance inAcinetobacterbaumannii6B92［J］.Antimicrob Agents Chemother，2000，44（1）：196-199.

［8］ 沈萍，廖康，周華，等.亞胺培南耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌同源性、碳青霉烯酶基因及其與ISAba1關(guān)系研究.《第六屆全國(guó)抗菌藥物臨床藥理學(xué)術(shù)會(huì)議論文集》［C］.第六屆全國(guó)抗菌藥物臨床藥理學(xué)術(shù)會(huì)議，北京，2006.

［9］ He C，Xie Y，Zhang L，et al.Increasing imipenem resistance and dissemination of the ISAba1-associated blaOXA-23 gene amongAcinetobacterbaumanniiisolates in an intensive care unit［J］.J Med Microbiol，2011，60（Pt 3）：337-341.

［10］ 馬序竹，呂媛，張佳，等，耐亞胺培南鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥性及OXA碳青霉烯酶檢測(cè)［J］.中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志，2011，27（4）：268-271.

The resistance mechanism and molecular epidemiology of carbapenem-resistantAcinetobacterbaumanniiin an intensive care unit

MAOPu，QIUGuixia，YEDan，LIUXiaoqing，LIYimin. （DepartmentofInfectionControl，The FirstAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalCollege，Guangzhou510120，China）

ObjectiveTo analyze the carbapenemase genotypes and homogeneity among the isolates ofAcinetobacterbaumannii，and identify the factors contributing to the increasing carbapenem resistance.MethodsWHONET 5.0 software was used to analyze the changing prevalence of antibiotic resistance.Thirty-five carbapenem-resistantA.baumanniiisolates were collected from an Intensive Care Unit between 2008 and 2009.All strains were identified by VITEK-2 and tested by Kirby-Bauer disk diffusion test.The carbapenemases and their relationship with ISAba1，metallo-β-lactamases genes were analyzed by PCR.Genotyping were conducted by pulsed-field gel electrophoresis.ResultsThe prevalence of meropenem-resistant strains increased rapidly from 10.8%to 62.3%，and imipenem-resistant strains increased from 13.5%to 58.8%.Eight clones were identified in the 35A.baumanniistrains.TheblaOXA-51，blaOXA-23，andblaOXA-58genes were identified in 94.29% （33／35），57.14% （20／35）and 17.14% （6／35）of theseA.baumanniistrains，respectively.ISAba1-associatedblaOXA-23genes were prevalent in carbapenem-resistantA.baumannii.No metallo-β-lactamases gene was identified.ConclusionsOXA-type carbapenemases（mainly OXA-23）play an important role in carbapenem-resistantA.baumannii.Attention should be paid to the cross-infection and prevalence of carbapenem-resistantA.baumanniiin ICU.

Acinetobacterbaumannii； carbapenemase； pulsed-field gel electrophoresis

黎毅敏，E-mail：lymin98＠yahoo.com。

R978.12；R378

A

1009-7708（2012）06-0449-04

廣州市教育局創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)科研基金（B94117）；廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2010J-E171）。

廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院醫(yī)院感染管理部，廣州 510120；＊呼吸疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣州呼吸疾病研究所；＊＊重癥醫(yī)學(xué)科。

毛璞（1981—），女，助理研究員，博士，主要從事醫(yī)院感染控制與細(xì)菌耐藥研究。

2012-06-01

·論著·