孟 萍，尹建康，高曉靜，劉 平，王 凡，王 靜

(江西中醫(yī)藥高等專科學(xué)校，江西撫州 344000)

白術(shù)對慢傳輸型便秘大鼠結(jié)腸組織Cajal間質(zhì)細(xì)胞的影響*

孟 萍，尹建康，高曉靜，劉 平，王 凡，王 靜

(江西中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，江西撫州 344000)

目的：運(yùn)用免疫組化方法檢測白術(shù)對慢傳輸型便秘(slow transit constipation，STC)大鼠結(jié)腸組織Cajal間質(zhì)細(xì)胞(interstitial cells of Cajal，ICC)的影響，進(jìn)一步闡釋白術(shù)治療STC的機(jī)制。方法：隨機(jī)將成年健康SD大鼠60只分為空白對照組、模型對照組、白術(shù)低劑量組(30 g生藥/kg)、白術(shù)中劑量組(60 g生藥/kg)、白術(shù)高劑量組(120 g生藥/kg)，每組12只。應(yīng)用大黃對除空白對照組以外的大鼠進(jìn)行慢傳輸型便秘模型制備。造模成功后，空白及模型對照組給予生理鹽水2 mL灌胃，白術(shù)低、中、高劑量組分別給予3 g生藥/mL、6 g生藥/mL、12 g生藥/mL的白術(shù)水煎液2 mL，早晚2次，連續(xù)15 d。15 d中連續(xù)觀察大鼠皮毛光澤、活動范圍、進(jìn)食量及排便情況。末次給藥后用免疫組化法觀察結(jié)腸ICC的形態(tài)和數(shù)量。結(jié)果：模型對照組大鼠結(jié)腸較其他各組粗大、迂曲，腸腔內(nèi)有較大塊較多粒糞便存留，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。各組大鼠在給藥前體質(zhì)量差別均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，而處死前各組大鼠體質(zhì)量差別均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。c-kit免疫組化法染色半定量分析，各組差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。400倍光鏡下白術(shù)低劑量組、白術(shù)中劑量組鏡下所見與空白對照組相似，區(qū)別不大，ICC數(shù)量差異不大;而模型對照組及白術(shù)高劑量組ICC均有所改變，形態(tài)出現(xiàn)異常，體積變小，核周胞漿突起變鈍、變短，ICC數(shù)量差異較大，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。結(jié)論：白術(shù)可以改善結(jié)腸組織中 ICC形態(tài)并提高ICC數(shù)量，劑量60 g的生白術(shù)能將上述效應(yīng)發(fā)揮最好。

白術(shù)/藥效學(xué);慢傳輸型便秘/藥物作用;Cajal間質(zhì)細(xì)胞

慢傳輸型便秘(slow transit constipation，STC)是指由于各種原因造成的結(jié)腸運(yùn)動功能遲緩，傳輸糞便功能下降而導(dǎo)致的便秘，于1986年被首次提出，臨床上以結(jié)腸通過時間延長和對纖維素、緩瀉劑治療反應(yīng)差為特征。Cajal間質(zhì)細(xì)胞(interstitial cells of Cajal，ICC)是胃腸道神經(jīng)系統(tǒng)的一種非神經(jīng)但又與神經(jīng)密切相關(guān)的特殊間質(zhì)細(xì)胞。研究表明：ICC可能是腸道慢波的起搏者，有潛在的控制胃腸道動力的作用。ICC減少在STC患者結(jié)腸動力障礙的發(fā)生機(jī)制中起到非常關(guān)鍵的作用［1］。白術(shù)一向被看作“健脾燥濕藥”，具有止瀉作用;但《傷寒論》第174條曰“傷寒八九日……其人大便硬，小便自利者，去桂加白術(shù)湯主之”，且白術(shù)用量為 4兩(120 g)，為后世醫(yī)家疑之。1978年魏龍驤老中醫(yī)介紹大劑量白術(shù)治療便秘有效［2］，始引起學(xué)者重視。本研究運(yùn)用免疫組化及鏡檢檢測不同劑量的白術(shù)水煎液對STC大鼠結(jié)腸組織ICC的影響旨在從微觀進(jìn)一步闡釋白術(shù)治療STC的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動 物

SD大鼠60只，雌雄各半，清潔級，體質(zhì)量120～150 g，由江西中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗動物管理中心提供，許可證號為SCXK(贛)2005－0001，動物質(zhì)量合格證號為JZDW2009－0309，由江西中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校實(shí)驗動物管理中心飼養(yǎng)。

1.2 藥品與試劑

白術(shù)與1000 g大黃粉均由江西中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校附屬醫(yī)院中藥房提供，其中白術(shù)被制成低、中、高3種劑量水煎液，分別為30，60，120 g生藥/kg。兔多抗c-kit抗體(一抗)，Santa Cruz公司產(chǎn)品，批號09011222;兔/鼠兩步法試劑盒(二抗)，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，批號09032105;DBA顯色液，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，批號08112302。

1.3 動物分組、模型的建立與給藥

隨機(jī)將60只大鼠分為空白對照組、模型對照組、白術(shù)低劑量組(30 g生藥/kg)、白術(shù)中劑量組(60 g生藥/kg)及白術(shù)高劑量組(120 g生藥/kg)，每組12只。除空白對照組大鼠灌胃生理鹽水外，其余大鼠灌胃含大黃粉懸液以建立模型。大黃的用量開始時為0.6 mg/(g·d)，以后每日在前日的基礎(chǔ)上加倍，直到出現(xiàn)半數(shù)致瀉，再保持此劑量到80%小鼠稀便消失，然后在此基礎(chǔ)上加倍給藥，又有近半數(shù)大鼠出現(xiàn)腹瀉。如此循環(huán)3次，待最后80%小鼠稀便消失1周后停藥，以誘導(dǎo)實(shí)驗性STC大鼠模型。成功造模后，空白對照及模型對照組給予生理鹽水2 mL灌胃，白術(shù)低、中、高劑量組分別給予3，6，12 g生藥/mL的白術(shù)水煎液2 mL，每組早晚2次，連續(xù)15 d。15 d中連續(xù)觀察大鼠皮毛光澤、活動范圍、進(jìn)食量及排便情況。

1.4 檢測指標(biāo)

①觀察大鼠皮毛光澤情況、活動范圍、進(jìn)食量和排便情況。②觀察大鼠結(jié)腸大體形態(tài)，殘留糞粒數(shù)量、每粒糞便質(zhì)重及大鼠體質(zhì)量的變化。③進(jìn)行結(jié)腸c-kit免疫組化染色半定量分析。免疫組化結(jié)果判斷：棕黃色為陽性信號，以“－、+、++、+++”表達(dá)染色的深淺。(－)為陰性染色，(+)為弱陽性染色，(++)為陽性染色，(+++)為強(qiáng)陽性染色。④在400倍光學(xué)顯微鏡下觀察ICC形態(tài)并計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)。

取材及標(biāo)本處理：停藥后大鼠禁食不禁水12 h;將各組大鼠頸椎脫臼處死，打開腹腔，分離大腸;切取結(jié)腸段區(qū)域環(huán)肌層組織約1 cm，縱向剪開，在預(yù)冷的生理鹽水中清洗去除內(nèi)容物;放入100 g/L甲醛溶液中固定24 h，常規(guī)脫水，石蠟包埋;采用連續(xù)橫斷面組織切片切取厚4 μm組織塊;每張載玻片上貼4個組織塊，40℃烘干10 h，常規(guī)HE染色和c-kit免疫組化染色，c-kit免疫組化染色按試劑盒步驟進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠皮毛光澤、活動范圍、進(jìn)食量和大便情況對比

模型對照組大鼠皮毛枯少無光、神情呆滯、活動力不佳、活動范圍小、愛扎堆、進(jìn)食少、大便硬且少?？瞻讓φ战M大鼠皮毛光滑、精神活潑，活動范圍大、進(jìn)食好且量多、大便軟而成形。白術(shù)低、中劑量組大鼠的表現(xiàn)與空白對照組大鼠相差不大，但中劑量組稍好于低劑量組;白術(shù)高劑量組的上述諸指標(biāo)不佳，與模型對照組大鼠相似。

2.2 各組大鼠結(jié)腸大體形態(tài)觀察、殘留糞粒數(shù)量、每粒糞便質(zhì)重、大鼠體質(zhì)量變化對比

模型對照組大鼠結(jié)腸明顯粗大、迂曲，腸腔內(nèi)有較大塊較多粒糞便存留，與空白對照組對比差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。白術(shù)各組大鼠結(jié)腸呈一般粗大、迂曲，腸腔內(nèi)存留較小塊較少粒糞便，與模型對照組對比差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。各組大鼠在給藥前體質(zhì)量差別均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。處死前的各組大鼠體質(zhì)量對比：模型對照組與空白對照組間差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，白術(shù)各劑量組與模型對照組間差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05或 P ＜0.01)。見表1。

表1 各組大鼠結(jié)腸內(nèi)殘留糞粒數(shù)量、每粒糞便質(zhì)重、大鼠體質(zhì)量變化對比 n=12，±s

表1 各組大鼠結(jié)腸內(nèi)殘留糞粒數(shù)量、每粒糞便質(zhì)重、大鼠體質(zhì)量變化對比 n=12，±s

注：與空白對照組對比，*P ＜0.05;與模型對照組對比，#P ＜0.05，##P ＜0.01。

組 別 糞便粒數(shù)/(?！ぶ唬?) 糞便質(zhì)重/(mg·粒－1) 給藥前體質(zhì)量/(mg·只－1) 處死前體質(zhì)量/(mg·只－1)空白對照組7 ±2.6 81.6 ±9.1 262 ±11.56 351 ±20.67模型對照組 9 ±1.8* 153.4 ±13.3* 254 ±22.52 276 ±20.14*白術(shù)低劑量組 6 ±2.3# 106.6±7.5# 260±18.23 287 ±19.58#白術(shù)中劑量組 4 ±1.9## 89.6 ±10.2## 258±19.35 367 ±21.63##白術(shù)高劑量組 8 ±3.1# 131.6±11.7# 253±21.41 290 ±17.72#

2.3 各組大鼠結(jié)腸c-kit免疫組化染色半定量分析

大鼠結(jié)腸黏膜HE染色顯示上皮細(xì)胞核呈藍(lán)色，胞漿為棕黃色。各組大鼠結(jié)腸免疫組化染色半定量分析對比，差別均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表2 各組大鼠結(jié)腸c-kit免疫組化染色半定量分析n=12，個

2.4 各組大鼠結(jié)腸ICC形態(tài)與數(shù)量對比

空白對照組可見ICC核大，圓形或卵圓形，核周胞漿少;核周胞漿向不同方向發(fā)出2～5條長突起，可有2級分支;細(xì)胞位于神經(jīng)節(jié)纖維的三級分支所形成的網(wǎng)眼中，胞體或其發(fā)出的突起與神經(jīng)纖維關(guān)系密切，但不相連。白術(shù)低劑量組、白術(shù)中劑量組鏡下所見ICC形態(tài)與空白對照組相似，區(qū)別不大;而模型對照組及白術(shù)高劑量組ICC均有所改變，形態(tài)出現(xiàn)異常，核周胞漿突起變鈍、變短。

白術(shù)低劑量組、白術(shù)中劑量組鏡下所見ICC數(shù)量與空白對照組相近，但白術(shù)中劑量組相對于白術(shù)低劑量組而言與空白對照組數(shù)值更接近，且高于空白對照組;而模型對照組及白術(shù)高劑量組陽性細(xì)胞數(shù)量均明顯少于前3組，且模型對照組數(shù)值為5組中最低。模型對照組與空白對照組對比，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);白術(shù)各劑量組與模型對照組對比，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05或 P ＜0.01)。見表3。

表3 各組大鼠結(jié)腸400倍光鏡下ICC陽性細(xì)胞數(shù)量對比n=12，± s

表3 各組大鼠結(jié)腸400倍光鏡下ICC陽性細(xì)胞數(shù)量對比n=12，± s

注：與空白對照組對比，* P＜0.05;與模型對照組對比，#P＜0.05，##P ＜0.01。

組 別 400倍光鏡下ICC陽性細(xì)胞數(shù)量/個空白對照組85.82 ±4.12模型對照組 53.58 ±8.37*白術(shù)低劑量組 78.36 ±5.14#白術(shù)中劑量組 87.47 ±3.04##白術(shù)高劑量組 58.74 ±6.81#

3 討論

近來的研究［3］發(fā)現(xiàn)：ICC數(shù)量及分布的改變在STC的發(fā)病中可能起著重要的作用。Lee等［4］對STC患者乙狀結(jié)腸標(biāo)本研究發(fā)現(xiàn)：各層組織中ICC數(shù)量均減少。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為：脾胃氣虛是STC發(fā)病的主要病機(jī)，健脾益氣是治療STC的基本原則。白術(shù)性溫味苦甘，歸脾胃經(jīng)，功能分健脾益氣、燥濕利水、固表止汗、安胎。本研究表明：白術(shù)治療STC不是單純促進(jìn)腸管蠕動而通便，而是通過改善結(jié)腸ICC形態(tài)并提高ICC數(shù)量而取效。生白術(shù)單用治療STC需大量，但宜控制在60 g左右，這與魏龍驤老中醫(yī)經(jīng)驗相符。

［1］Aguchi T，Suita S，Masumoto K，et al.Universal distribution of c-kit-positive cells in different types of Hirschsprung＇s disease［J］.Pediatr Surg Int.2003，19(4)：273.

［2］魏龍驤.談白術(shù)治便秘［J］.新醫(yī)藥學(xué)雜志，1978，11(4)：9.

［3］Aguchi T，Suita S，Masumoto K，et a1.Universal distribdtion of c-kit-positive cells in different types of Hirschsprung＇s disease［J］.Pediatr Surg Int，2003，19(4)：273.

［4］Lee JI，Park H，Kamm MA，et a1.Decreased density of interstitial cells of Cajal and neuronal cells in patients with slowtransit constipation and acquired megacolon［J］.J G astroenterol Hepatol，2005，20(8)：1292 －1298.

R285.5

B

10.3969/j.issn.1001 －6910.2012.09.030

江西省教育廳青年科學(xué)基金項目(編號GJJ09629)

2011－12－09;

2012－03－28

(編輯 陶 珠)