黃文輝，盧守燕*，湯 羽

(甘肅省人民醫(yī)院1.腎內(nèi)科;2.檢驗(yàn)科，甘肅蘭州730000)

福辛普利抑制LPS誘導(dǎo)的人腎小管上皮HK－2細(xì)胞TAK1表達(dá)

黃文輝1，盧守燕1*，湯 羽2

(甘肅省人民醫(yī)院1.腎內(nèi)科;2.檢驗(yàn)科，甘肅蘭州730000)

目的 探討福辛普利(FOS)對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)增殖及對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β激活激酶(TAK1)表達(dá)的影響。方法 體外培養(yǎng)正常HK-2細(xì)胞，分為3組:對(duì)照組(Ctrl)、LPS誘導(dǎo)組(10 μg/L)、FOS干預(yù)組(LPS 10 μg/L+FOS 1×106mol/L)。細(xì)胞培養(yǎng)12、24和48 h，以甲基噻唑基四唑(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法觀(guān)察細(xì)胞上清纖維黏連蛋白(FN)變化，Western blot法檢測(cè)TAK1、FN蛋白表達(dá)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)TAK1mRNA的含量。結(jié)果 LPS誘導(dǎo)組較對(duì)照組細(xì)胞的增殖水平(在48 h分別為0.462±0.013及0.363±0.014)、胞質(zhì)中FN的含量均顯著增高，且自12 h開(kāi)始TAK1蛋白(在48 h分別為1.627±0.101及0.547±0.010)及mRNA表達(dá)水平上調(diào)(P＜0.01，P＜0.05)，F(xiàn)OS干預(yù)組細(xì)胞增殖(在48 h為0.396±0.011)、FN的含量及TAK1的表達(dá)(在48 h蛋白表達(dá)為1.308±0.097)較同時(shí)間點(diǎn)LPS組(在48 h蛋白表達(dá)為1.627±0.101)顯著下調(diào)(P＜0.01)。結(jié)論FOS可能通過(guò)抑制HK-2的增生與活化，減輕細(xì)胞外基質(zhì)FN的沉積，起到延緩腎間質(zhì)纖維化的作用。

福辛普利;人腎小管上皮細(xì)胞;轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β激活激酶;腎間質(zhì)纖維化

許多研究表明，在各種慢性腎臟疾病進(jìn)展過(guò)程中，腎小管上皮細(xì)胞、腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞等腎間質(zhì)細(xì)胞在各種細(xì)胞因子的作用下，相互促進(jìn)腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)生與發(fā)展［1］。其中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是重要的致纖維化因子，可以促進(jìn)小管上皮細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)包括纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)的產(chǎn)生［2］。而轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β激活激酶(TGFβ-activated kinase 1，TAK1)是TGF-β1下游信號(hào)分子，是絲裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinases，MAPKs)家族成員之一，與許多疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)［3］。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(angiotension converting enzyme inhibitors，ACEI)福辛普利(fosinopril，F(xiàn)OS)已被大量腎臟疾病動(dòng)物模型及臨床研究證實(shí)，其具有延緩腎功能惡化、保護(hù)腎臟的作用［4］，然而關(guān)于FOS對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞(human renal tubular epithelial cells，HK-2)作用的研究較少。因此，本研究觀(guān)察FOS對(duì)脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)下HK-2增殖、分泌細(xì)胞外基質(zhì)FN及對(duì)TAK1表達(dá)的影響，探討FOS腎保護(hù)作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑:福辛普利(上海施貴寶公司);優(yōu)級(jí)胎牛血清(杭州四季青公司)，F(xiàn)12/DMEM(1∶1)培養(yǎng)液、Hepes、胰蛋白酶(Gibco 公司)，纖維連接蛋白(FN)ELISA試劑盒(ADL公司)，脂多糖(LPS)(Sigma公司)，Trizol(Invitrogen公司)，兔抗大鼠TAK1多克隆抗體、鼠抗FN、β-actin單克隆抗體(Cell Signaling公司)，HRP標(biāo)記羊抗兔、抗鼠IgG二抗(Santa Cruz公司)，PVDF Western轉(zhuǎn)印膜、ECL Plus化學(xué)發(fā)光試劑盒(Millipore公司)，RIPA裂解液(北京普利萊公司)，PCR引物(上海英駿公司)。

1.1.2 動(dòng)物與細(xì)胞:清潔級(jí)雄性Wistar大鼠10只，體質(zhì)量160～180 g，由蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)SCXK(甘)2004-2006。正常人近端腎小管上皮細(xì)胞系HK-2由蘭州陸軍總醫(yī)院細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

1.2 含藥血清的制備及HK-2培養(yǎng)

每日灌胃給大鼠福辛普利10 mg/kg，共7 d，獲得含藥血清，對(duì)照組給予等體積0.9%氯化鈉注射液，于末次給藥后1h心臟穿刺取血，3 000 r/min離心10 min分離血清，56 ℃水浴30 min滅活，0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌，－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩K-2接種于含10%胎牛血清(FBS)的F12/DMEM(F/D 1∶1)培養(yǎng)液中，37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱孵育。細(xì)胞生長(zhǎng)至80% ～90%匯合時(shí)傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期常規(guī)消化后以1×105/mL接種于6孔培養(yǎng)板，至亞融合狀態(tài)以無(wú)血清F/D培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞進(jìn)入靜止期，棄舊培養(yǎng)液，加入含相應(yīng)試劑的10%胎牛血清F/D完全培養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞分組及樣品收集

將細(xì)胞分為3組:對(duì)照組(正常培養(yǎng)液)、LPS誘導(dǎo)組(LPS 10 μg/L)以及 FOS 干預(yù)組(LPS 10 μg/L+FOS 1×106mol/L)。分別培養(yǎng)12、24 和48 h，以MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，收集細(xì)胞上清液，離心后－80℃保存?zhèn)溆肊LISA檢測(cè)，收集細(xì)胞用于提取蛋白及mRNA。

1.4 指標(biāo)檢測(cè)及方法

1.4.1 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn):HK-2接種于96孔板，亞融合狀態(tài)時(shí)同步后按上述分組孵育，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。在各時(shí)間點(diǎn)分別加入含1 g/L MTT培養(yǎng)液100 μL孵育4 h，棄上清，加入二甲基亞砜(DMSO)溶解，對(duì)照組直接加DMSO定零點(diǎn)值，充分震蕩后，在酶標(biāo)儀上用檢測(cè)波長(zhǎng)570 nm、參考波長(zhǎng)630 nm作比色分析，測(cè)各孔吸光度值(A)。

1.4.2 ELISA法測(cè)定FN含量:按ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，各時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞分別取培養(yǎng)上清液100 μL，加入酶標(biāo)板孔內(nèi)，依次加入各種試劑，酶標(biāo)儀492 nm處檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品及樣品A值。

1.4.3 Western印跡檢測(cè)細(xì)胞TAK1及FN蛋白的表達(dá):各時(shí)間點(diǎn)收集各組細(xì)胞，加入300 μL含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液冰浴提取總蛋白，BCA法測(cè)定總蛋白濃度。各組取等量蛋白樣品上樣，加入5×上樣緩沖液12%SDS-PAGE電泳90 min，轉(zhuǎn)膜(PVDF膜)90 min，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST洗膜3次 ×10 min，分別加入一抗(TAK1 1∶500，F(xiàn)N 1∶1 000)搖床4℃過(guò)夜，TBST洗 3次 ×10 min，用HRP標(biāo)記的二抗(1∶5 000)孵育2 h，TBST洗3次×10 min，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，X膠片曝光、顯影和定影，對(duì)照Marker確定特異性目的條帶，掃描圖像。同一張膜曝光后以0.5%SDS洗脫抗體，再以β-actin抗體(1∶1 000)孵育雜交，作為內(nèi)參照。以累積吸光度(IA)比值表示表達(dá)量(目的蛋白條帶/內(nèi)參蛋白條帶)。

1.4.4 RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞TAK1mRNA的表達(dá):收集各時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞，Trizol提取總RNA，紫外分光光度儀測(cè)定RNA濃度。Rotor-Gene 3000熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行兩步法Real Time PCR反應(yīng)。2 μg總RNA利用反轉(zhuǎn)錄酶PrimeScriptTM緩沖液進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將 mRNA反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，然后以25 μL體系進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為:預(yù)變性95℃ 10 s，變性95℃ 5 s，退火、延伸60℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。PCR引物序列如下:TAK1正義鏈:5'-C CATCCCAATGGCGTATCTTACA-3'，反義鏈:5'-TCAT CCTGGTCCAATTCTGCAA-3'，產(chǎn)物190 bp;β-actin 正義鏈:5'-GCAAGCAGGAGTATGACGAGT-3'，反義鏈:5'-CTGCGCAAGTTAGGTTTTGTC-3'，產(chǎn) 物 112 bp。每個(gè)樣本重復(fù)3次，以β-actin為內(nèi)參照，采用相對(duì)定量的2－△△CT法分析PCR結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS16.0軟件，計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，其中兩組間比較用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 HK-2細(xì)胞增殖情況

與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組相比，LPS誘導(dǎo)組細(xì)胞明顯增殖，且細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生改變，從原有典型的鋪路石樣上皮細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)殚L(zhǎng)梭形，類(lèi)似于成纖維細(xì)胞(P＜0.01，P＜0.05);FOS干預(yù)組細(xì)胞增殖速度較同時(shí)間點(diǎn)LPS組比較明顯減緩(P＜0.01)(表1)。

表1 不同時(shí)間MTT檢測(cè)各組HK-2細(xì)胞增殖情況Table 1 HK-2 proliferation detected by MTT of different groups in different time(±s，A value，n=6)

表1 不同時(shí)間MTT檢測(cè)各組HK-2細(xì)胞增殖情況Table 1 HK-2 proliferation detected by MTT of different groups in different time(±s，A value，n=6)

*P＜0.01，＊＊P＜0.05 compared with control group;#P＜0.01 compared with LPS group．

group 12 hours 24 hours 48 hours control 0.216±0.018 0.285±0.010 0.363±0.014 LPS 0.284±0.016* 0.378±0.014* 0.462±0.013*FOS+LPS 0.241±0.032*# 0.303±0.019＊＊# 0.396±0.011*#

2.2 HK-2細(xì)胞培養(yǎng)上清中FN含量檢測(cè)

在常規(guī)培養(yǎng)條件下，對(duì)照組細(xì)胞可分泌少量FN;隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，LPS組細(xì)胞FN含量均有一定程度的增加，且顯著高于同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組(P＜0.01);FOS干預(yù)組細(xì)胞FN含量顯著低于同時(shí)間點(diǎn)LPS組(P＜0.01)(表2)。

表2 各組HK-2細(xì)胞不同時(shí)間FN含量的比較Table 2 Comparison of FN levels in HK-2 of different groups in different time(±s，A value，n=8)

*P＜0.01 compared with control group;#P＜0.01 compared with LPS group．

group 12 hours 24 hours 48 hours control 0.212±0.014 0.239±0.017 0.249±0.010 LPS 0.311±0.015* 0.377±0.025* 0.518±0.031*FOS+LPS 0.252±0.013# 0.305±0.016# 0.352±0.017#

2.3 HK-2細(xì)胞TAK1及FN蛋白的表達(dá)

在常規(guī)培養(yǎng)條件下，TAK1及FN蛋白在對(duì)照組有少量表達(dá)，LPS誘導(dǎo)后，各時(shí)間點(diǎn)TAK1及FN蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P＜0.01);FOS干預(yù)組在各時(shí)間點(diǎn)對(duì)LPS誘導(dǎo)的HK-2分泌TAK1及FN表達(dá)明顯下降(P＜0.01)(表3，圖1)。

表3 各組HK-2細(xì)胞不同時(shí)間TAK1和FN蛋白的表達(dá)Table 3 TAK1 and FN protein expressions in HK-2 of different groups in different time(±s，n=5)

表3 各組HK-2細(xì)胞不同時(shí)間TAK1和FN蛋白的表達(dá)Table 3 TAK1 and FN protein expressions in HK-2 of different groups in different time(±s，n=5)

*P＜0.01 compared with control group;#P＜0.01 compared with LPS group．

items group 12 hours 24 hours 48 hours TAK1/β-actin control 0.546±0.014 0.548±0.0110.547±0.010 LPS 0.674±0.014* 1.069±0.067* 1.627±0.101*FOS+LPS 0.600±0.057# 0.871±0.032# 1.308±0.097#FN/β-actin control 0.242±0.012 0.242±0.020 0.259±0.006 LPS 0.586±0.027* 0.850±0.033* 1.170±0.096*FOS+LPS 0.457±0.025# 0.645±0.033# 0.814±0.029#

圖1 各組細(xì)胞不同時(shí)間TAK1和FN蛋白的表達(dá)Fig 1 Expressions of TAK1 and FN protein in HK-2 of different groups in different time

2.4HK-2細(xì)胞TAK1 mRNA的表達(dá)

HK-2細(xì)胞TAK1mRNA于LPS誘導(dǎo)12 h時(shí)表達(dá)開(kāi)始上調(diào)，各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組(P＜0.01);FOS干預(yù)組TAK1mRNA表達(dá)量與同時(shí)間點(diǎn)相比顯著下降(P＜0.01)(表4)。

表4 各組HK-2細(xì)胞不同時(shí)間TAK1 mRNA的表達(dá)Table 4 The expression of TAK1 mRNA in HK-2 of different group in different time(±s，2 －△△CT，n=5)

表4 各組HK-2細(xì)胞不同時(shí)間TAK1 mRNA的表達(dá)Table 4 The expression of TAK1 mRNA in HK-2 of different group in different time(±s，2 －△△CT，n=5)

*P＜0.01 compared with control group;#P＜0.01 compared with LPS group．

group 12 hours 24 hours 48 hours control 1.000±0.000 1.046±0.020 1.042±0.027 LPS 1.655±0.032* 2.421±0.217* 3.461±0.215*FOS+LPS 1.355±0.027# 1.559±0.139# 2.593±0.318#

3 討論

腎間質(zhì)纖維化是常見(jiàn)的腎臟病理過(guò)程，腎臟固有細(xì)胞中，腎小管上皮細(xì)胞在許多因素包括細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下，可以轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞，參與腎間質(zhì)纖維化，TGF-β1被認(rèn)為是最重要的致纖維化因子之一［5］。由于腎小管上皮細(xì)胞的存在，其轉(zhuǎn)分化過(guò)程的進(jìn)展程度對(duì)于腎臟病的預(yù)后有著重要意義，故尋找有效的抑制腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及致纖維化因子活化的因素，對(duì)于緩解腎臟疾病的進(jìn)展至關(guān)重要。

TAK1最初被認(rèn)為是MAPKKK家族成員之一，研究證明，在包括LPS、炎性反應(yīng)因子等各種細(xì)胞外刺激的作用下，TAK1的蘇氨酸酪氨酸被雙磷酸化而激活［6］。TAK1通路下游激酶依次被磷酸化激活后的作用底物為一些轉(zhuǎn)錄因子，可導(dǎo)致多種重要基因產(chǎn)物表達(dá)上調(diào)，以及細(xì)胞表面受體的表達(dá)增多［7］。在腎間質(zhì)纖維化過(guò)程中的不同階段，炎性反應(yīng)因子和相關(guān)細(xì)胞因子的釋放、ECM的產(chǎn)生、腎小管上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化可能有TAK1的參與，但目前這方面的研究較少，本研究應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，探尋在LPS誘導(dǎo)下HK-2中TAK1的表達(dá)，為進(jìn)一步尋找促纖維化因子提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

FOS是一種新型ACEI，經(jīng)肝、腎雙通道排泄，可以降低腎小球內(nèi)壓力，減少尿蛋白，延緩腎功能受損的進(jìn)展，具有很好的腎保護(hù)作用［8］。但FOS對(duì)腎臟保護(hù)作用的機(jī)制尚不完全清楚，既往對(duì)FOS保護(hù)腎臟作用機(jī)制的研究大多是從血流動(dòng)力學(xué)方面著手的，比如FOS可以通過(guò)抑制腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)的過(guò)度激活，降低血漿和組織中血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)的生成，達(dá)到抗纖維化的作用［9］。

本研究以HK-2為研究對(duì)象，觀(guān)察FOS對(duì)體外培養(yǎng)HK-2增殖及TAK1表達(dá)的影響。從PCR及Western印跡結(jié)果來(lái)看，LPS可誘導(dǎo)HK-2表達(dá)TAK1增加，經(jīng)過(guò)FOS干預(yù)后，HK-2表達(dá)TAK1蛋白及mRNA水平均下降，提示TAK1信號(hào)通路在LPS誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞增殖中起了重要作用，F(xiàn)OS可能通過(guò)影響TAK1信號(hào)通路，下調(diào)TAK1蛋白及mRNA的表達(dá)，從非血流動(dòng)力學(xué)方面起到了腎臟保護(hù)作用。

總之，F(xiàn)OS可能通過(guò)抑制HK-2的增生與活化，減輕細(xì)胞外基質(zhì)FN的沉積，從而起到延緩腎間質(zhì)纖維化的作用，但其確切機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

［1］曹建南，郭漢城，丘昭文，等．MG-132對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化與凋亡的影響［J］．中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志，2009，10:404－408．

［2］殷薇，肖平，黃安蘭，等．蟲(chóng)草菌液拮抗人白蛋白致HK-2細(xì)胞增殖及TGF-β1、FN表達(dá)的影響［J］．中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2009，19:509－512．

［3］Inokuchi S，Aoyama T，Miura K，et al．Disruption of TAK1 in hepatocytes causes hepatic injury，inflammation，fibrosis，and carcinogenesis［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2010，107:844－849．

［4］張翠平，尚勇，符艷敏．福辛普利聯(lián)合羅格列酮對(duì)早期糖尿病腎病療效觀(guān)察［J］．現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2009，25:42－43．

［5］謝席勝，劉衡川，樊均明，等．人參皂甙Rb1對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞p47phox的表達(dá)及細(xì)胞外基質(zhì)的影響［J］．四川大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2009，40:106－110．

［6］Pang HY，Liu G，Liu GT．Compound FLZ inhibits lipopolysaccharide-induced inflammatory effects via down-regulation of the TAK-IKK and TAK-JNK/p38MAPK pathways in RAW264.7 macrophages［J］．Acta Pharmacol Sin，2009，30:209－218．

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［8］郝志宏，于力，王麗娜，等．福辛普利對(duì)大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1表達(dá)的影響［J］．中華婦幼臨床醫(yī)學(xué)雜志，2008，4:21－24．

［9］孟和，安桂鳳．福辛普利對(duì)高血壓病腎損害保護(hù)作用的療效觀(guān)察［J］．藥物與臨床，2009，47:87－88．

Fosinopril suppresses the expression of TAK1 of the human renal tubular epithelial cells induced by LPS

HUANG Wen-hui1，LU Shou-yan1*，TANG Yu2

(1.Dept．of Nephrology;2.Dept．of Clinical Laboratory，Gansu Provincial Hospital，Lanzhou 730000，China)

ObjectiveTo investigate the effects of fosinopril(FOS)on expression of TAK1 and proliferation of the human renal tubular epithelial cells induced by LPS．MethodsHuman renal tubular epithelial(HK-2)cells were divided into three groups:blank control group(Ctrl)，LPS group(10 μg/L)，F(xiàn)OS group(LPS 10 μg/L+FOS 1×106mol/L)．At 12，24，48 hours，HK-2 proliferation was detected by methyl thiazolyl tetrazolium(MTT)assay．The change of fibronectin(FN)in the supernatants of the cultured HK-2 was detected by enzymelinked immunosorbent assay(ELISA)．The protein expressions of TAK1 and FN were measured by Western blot．The mRNA expressions of TAK1 was measured by real-time quantitative PCR．ResultsThe cell proliferation and the expression of FN were increased，and the expressions of protein and mRNA of TAK1 in LPS group were upregulating significantly compared with control group from 12 h(P＜0.01，P＜0.05)，but they were downregulating in FOS group compared with LPS group(P＜0.01)．ConclusionsFOS probably delays renal interstitial fibrosis by inhibiting proliferation and activation of HK-2 and decreasing accumulation of extracellular matrix．

fosinopril;human renal tubular epithelial cells;TGFβ-activated kinase 1;renal interstitial fibrosis

R 692.6

A

1001-6325(2012)09-1088-05

2011－08－29

2011－12－26

*通信作者(corresponding author):lsylushouyan@163．com