陳春永，沈正清，葉君健*

(1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，福建福州350005;2.福建晉江市醫(yī)院骨科，福建晉江362200)

TWEAK和Fn14在腰椎間盤退變髓核組織中的表達(dá)及意義

陳春永1，沈正清2，葉君健1*

(1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，福建福州350005;2.福建晉江市醫(yī)院骨科，福建晉江362200)

目的 研究TWEAK和Fn14在腰椎間盤退變髓核組織中的表達(dá)及其臨床意義。方法 用半定量RT-PCR和免疫組織化學(xué)法檢測實(shí)驗(yàn)組(30例退變腰椎間盤)和對(duì)照組(10例創(chuàng)傷腰椎間盤)中TWEAK和Fn14mRNA及蛋白表達(dá)。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組TWEAKmRNA表達(dá)顯著高于對(duì)照組(0.949±0.093vs0.653±0.110，P＜0.01)，實(shí)驗(yàn)組TWEAK蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組(0.682±0.126vs0.397±0.057，P＜0.01)，實(shí)驗(yàn)組Fn14mRNA表達(dá)顯著高于對(duì)照組(0.936±0.125vs0.632±0.059，P＜0.01)，F(xiàn)n14蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組(0.540±0.051vs0.344±0.072，P＜0.01)。結(jié)論 TWEAK和Fn14的表達(dá)增加可能參與腰椎間盤退變的進(jìn)程。

腫瘤壞死因子樣凋亡微弱誘導(dǎo)劑;成纖維細(xì)胞因子誘導(dǎo)14;椎間盤;椎間盤退變

腫瘤壞死因子樣凋亡微弱誘導(dǎo)劑(TNF-like weak inducer of apoptosis，TWEAK)是腫瘤壞死因子超家族(tumor necrosis factor superfamily，TNFSF)的新成員，最早于1997年報(bào)道［1］，具有廣泛的生物學(xué)活性，參與了細(xì)胞增殖遷移［2－3］、誘導(dǎo)血管生成［5］、炎性反應(yīng)［5］及誘導(dǎo)凋亡［6］等病理過程。成纖維細(xì)胞因子誘導(dǎo)14(fibroblast growth factor-inducible 14，F(xiàn)n14)為TWEAK的受體。本研究旨在檢測腰椎間盤突出癥(lumbar disc herniation，LDH)患者退變腰椎間盤組織中TWEAK和Fn14的表達(dá)，初步探討TWEAK和Fn14與椎間盤退變(intervertebral disc degeneration，IDD)發(fā)病的相關(guān)性，進(jìn)而為臨床治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

實(shí)驗(yàn)組:腰椎間盤退變髓核組織，取自2009年11月－2010年6月期間在福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科住院手術(shù)的LDH患者，有典型臨床癥狀和體征，并經(jīng)磁共振(magnetic resonance imaging，MRI)確認(rèn)，無明顯的全身性免疫性疾病和急慢性感染，共30例(男性19例，女性11例)，平均年齡(49.6±13.0)(16～75)歲。對(duì)照組:腰椎間盤創(chuàng)傷髓核組織，取自2009年11月－2010年6月期間在福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科住院手術(shù)的腰椎創(chuàng)傷患者，外傷至手術(shù)不超過3 d，MRI檢查確認(rèn)椎間盤無明顯退變，傷前無長期腰腿疼痛、全身性免疫性疾病和明顯的急慢性感染，共10例(男性7例，女性3例)，平均年齡(34.9±11.4)(18～55)歲。兩組標(biāo)本取材前已告知患者，簽署知情同意書，并經(jīng)我院倫理委員會(huì)審查備案(閩醫(yī)大附一科研倫理審［2009］3號(hào))。

1.2 主要試劑

TWEAK兔抗人多克隆抗體(Bioworld公司);Fn14兔抗人多克隆抗體(Abcam公司);抗兔二抗試劑盒(福建邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司);Trizol與反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen公司);PCR試劑盒(北京莊盟國際生物基因科技有限公司);PCR的TWEAK、Fn14及內(nèi)參引物由上海生工生物技術(shù)公司設(shè)計(jì)合成(表1)。

表1 PCR引物序列Table 1 Primer sequence of PCR

1.3 方法

1.3.1 RT-PCR檢測TWEAK和Fn14mRNA表達(dá):取腰椎間盤髓核組織100 mg在液氮中磨碎，加1 mL Trizol徹底勻漿，經(jīng)0.2 mL氯仿處理后離心，上清液用異丙醇沉淀，冰預(yù)冷DEPC處理水配制的75%乙醇1 mL洗滌沉淀物，棄乙醇，室溫干燥后將沉淀溶于適量 DEPC水中，核酸紫外分析儀檢測，計(jì)算RNA純度與濃度，證實(shí)純度達(dá)要求，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。cDNA合成采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，將以下組分加入EP管中:1 μL oligo(dT)、2 μL 總 RNA、1 μL 10 mol/L dNTP、8 μL ddH2O;混合物在65 ℃加熱5 min后，迅速置于冰上冷卻。短暫離心后加入以下組分:4 μL第一鏈合成緩沖液、2 μL 0.1 mol/L DTT、1 μL RNaseOUTTM核酸酶抑制劑;在離心管中輕輕將各種成分混合，并在37℃下孵育2 min;室溫下加入1 μL M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶;37℃孵育50 min;70℃加熱15 min以終止反應(yīng);馬上進(jìn)行PCR反應(yīng)或－20℃保存。以RT反應(yīng)產(chǎn)物(cDNA)為模板，擴(kuò)增目的基因片段:建立25 μL的反應(yīng)體系:2 μL cDNA，12.5 μL MasterMix，各1 μL TWEAK 和 GAPDH 上下游引物，6.5 μL ddH2O。PCR 反應(yīng)條件:預(yù)處理 94℃5 min，58℃ 30 s、72℃ 60 s，30 次循環(huán)，72℃7 min。所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。Fn14的擴(kuò)增條件與TWEAK相同。

1.3.2 免疫組織化學(xué)SP法檢測TWEAK和Fn14蛋白表達(dá):免疫組化染色按SP法試劑盒說明書步驟進(jìn)行，切片經(jīng)脫蠟，微波熱抗原修復(fù)，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，加入一抗多克隆兔抗人TWEAK(或Fn14)、二抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水后透明，中性樹膠封片;空白對(duì)照采用PBS代替一抗。

1.4 結(jié)果判定

1.4.1 RT-PCR結(jié)果判定:采用1.2%瓊脂糖凝膠，加入8 μL的PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳，電壓110 mV，22 min，紫外透射儀下觀察并拍攝PCR特異性產(chǎn)物，通過PCR擴(kuò)增片段條帶位置與MarkerⅠ進(jìn)行比較，判斷擴(kuò)增片段的正確性。計(jì)算機(jī)圖像處理，測定各個(gè)條帶的吸光度值，以目的基因與內(nèi)參照的吸光度比值為半定量資料，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4.2 免疫組化結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn):TWEAK和Fn14主要為胞質(zhì)表達(dá)，胞質(zhì)著色呈棕黃色者為陽性細(xì)胞，淡黃色為弱陽性，不著色為陰性;切片用Ipp6.0軟件測吸光度作圖像分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)用均值 ±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行兩樣本均數(shù)t檢驗(yàn)和簡單相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 TWEAK和Fn14 mRNA在創(chuàng)傷及退變腰椎間盤中的表達(dá)

創(chuàng)傷及退變組椎間盤髓核組織均有TWEAK和Fn14mRNA的表達(dá)，退變組TWEAK和Fn14mRNA的表達(dá)明顯高于創(chuàng)傷組(P＜0.01)(圖1，2)。退變組TWEAK和Fn14的表達(dá)具有正相關(guān)性(P＜0.01)(圖3)。

圖1 創(chuàng)傷組及退變組TWEAK和Fn14 mRNA的表達(dá)Fig 1 Expression of TWEAK and Fn14 mRNA in the control group and the experimental group

圖4 腰椎間盤髓核組織TWEAK和Fn14免疫組化染色Fig 4 Expression of TWEAK and Fn14 in different pulpy nucleus tissues of lumbar discs by immunohistochemistry staining(×400)

2.2 TWEAK和Fn14蛋白在創(chuàng)傷及退變腰椎間盤中的表達(dá)

TWEAK和Fn14蛋白在創(chuàng)傷組及退變組腰椎間盤中均有表達(dá)，退變組腰椎間盤中的表達(dá)明顯高于創(chuàng)傷組腰椎間盤(P＜0.01)(圖4，5)。退變組TWEAK和Fn14的表達(dá)具有正相關(guān)性(P＜0.01)(圖3)。

3 討論

圖5 創(chuàng)傷組和退變組椎間盤髓核組織TWEAK和Fn14蛋白表達(dá)的比較Fig 5 Comparison of expression of TWEAK and Fn14 protein in pulpy nucleus tissues of lumbar disc in control group and experimental group

TWEAK是一種Ⅱ型膜蛋白，合成之初沒有活性，經(jīng)furin蛋白酶切割后分泌到細(xì)胞外，成為具有生物學(xué)活性的可溶性片段［7］。Fn14是一種Ⅰ型膜蛋白，為TWEAK的受體，其參與信號(hào)傳導(dǎo)的機(jī)制尚未完全闡明。目前對(duì)Fnl4的研究表明，該受體本身不具有蛋白激酶活性，是通過接頭分子(adaptor molecules)將其與下游信號(hào)傳導(dǎo)分子聯(lián)系起來。腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor，TNFR)相關(guān)因子家族(TNF receptor-associated factors，TRAF)是聯(lián)系Fnl4和下游信號(hào)傳導(dǎo)通路的一組重要接頭分子［8］。當(dāng)可溶性TWEAK作用于Fnl4陽性細(xì)胞株后，可通過 TRAF活化核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signalregulated kinase，ERK)、p38絲裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)和c-Jun氨基末端激酶(JNK)信號(hào)傳導(dǎo)通路［9］。TWEAK是否還激活其他信號(hào)傳導(dǎo)通路目前尚不明確。

椎間盤的退變與各種炎性反應(yīng)介質(zhì)有關(guān)，包括一氧化氮(nitric oxide，NO)、白細(xì)胞介素(interleukins，IL)、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor receptor，TNF)及其他細(xì)胞因子［10］。MMP-3 對(duì)椎間盤的破環(huán)作用至少包括兩條途徑:首先為直接降解椎間盤細(xì)胞外基質(zhì);其次，MMP-3在血管生成方面具有重要作用，而后者是腰椎間盤退變的重要特征［11］。TNF-α 和 IL-1β 可增加 MMP-3、MMP-13、促炎性反應(yīng)酶類、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶等促分解代謝蛋白酶的轉(zhuǎn)錄，而對(duì)Ⅱ型膠原、聚集蛋白聚糖、連接蛋白等基質(zhì)蛋白的轉(zhuǎn)錄則明顯抑制［12］。

本研究發(fā)現(xiàn)，在正常人腰椎間盤髓核組織中有TWEAK、Fn14mRNA和蛋白的表達(dá)，而在退變腰椎間盤髓核組織中的表達(dá)明顯增加，而且TWEAK、Fn14mRNA和蛋白的表達(dá)呈現(xiàn)正相關(guān)性。提示TWEAK和Fn14是腰椎間盤退變的重要調(diào)節(jié)因子，TWEAK和Fn14的表達(dá)增加可能參與腰椎間盤退變的進(jìn)程。有動(dòng)物研究表明TWEAK通過阻斷前體成骨和軟骨細(xì)胞分化來阻止椎間盤的內(nèi)源性修復(fù)。TWEAK和Fn14結(jié)合可誘導(dǎo)椎間盤細(xì)胞合成MMP-3。這種誘導(dǎo)作用可被TWEAK及Fn14的中和蛋白終止。也可被c-Jun氨基端激酶(JNK)抑制劑抑制，說明TWEAK和Fn14結(jié)合誘導(dǎo)MMP-3表達(dá)的信號(hào)傳導(dǎo)通過JNK途徑。TWEAK也可直接促進(jìn)椎間盤外基質(zhì)聚集蛋白聚糖的分解［13－14］。Huh等［15］取人椎間盤髓核培養(yǎng)研究，TWEAK 100 ng/mL即可明顯降低了椎間盤髓核Sox9和聚集蛋白聚糖mRNA的表達(dá)水平，加入Fn14 500 ng/mL共培養(yǎng)，則Sox9和聚集蛋白聚糖mRNA的表達(dá)水平進(jìn)一步下降。表明TWEAK即可與Fn14結(jié)合發(fā)揮作用，也可以其他的方式起作用。TWEAK和Fn14在人退變腰椎間盤髓核表達(dá)增加的原因和機(jī)制目前還不清楚，可能與負(fù)荷、損傷及各種細(xì)胞因子有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

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Expression and significance of TWEAK and Fn14 in the degenerated and traumatic lumbar discs

CHEN Chun-yong1，SHEN Zheng-qing2，YE Jun-jian1*

(1.Dept．of Orthopaedics，the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University，F(xiàn)uzhou 350005;2.Dept．of Orthopaedics，Jinjiang Municipal Hospital of Fujian Province，Jinjiang 362200，China)

ObjectiveTo investigate the expression of TWEAK and Fn14 in nucleus pulposus of human degenerated lumbar discs and to evaluate the clinical significance．MethodsmRNA and protein expression of TWEAK and Fn14 in the experimental group(30 fresh pulpy nucleus of patients with lumbar disc herniation)and the control group(10 fresh pulpy nucleus of patients with traumatic lumbar vertebrae)were detected by semi-quantitative RTPCR and immunohistochemical staining．ResultsmRNA expression ofTWEAKwas significantly higher in the experimental group when compared with that of the control group(0.949±0.0931vs0.653±0.110，P＜0.01);It was same to TWEAK protein(0.682±0.126vs0.397±0.057，P＜0.01);Fn14mRNA(0.936±0.125vs0.632±0.059，P＜0.01);and Fn14 protein(0.540±0.051vs0.344±0.072，P＜0.01)．ConclusionsThe increased expression of TWEAK and Fn14 in degenerate lumbar discs indicates that TWEAK and Fn14 may be involved in the process of lumbar intervertebral disc degeneration(IDD)．

tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis;fibroblast growth factor-inducible 14;intervertebral disc;intervertebral disc degeneration

R 681.5

A

1001-6325(2012)09-1053-06

2010－11－02

2011－12－09

福建省自然科學(xué)基金(C0710010);福建醫(yī)科大學(xué)教授基金(JS09007)

*通信作者(corresponding author):yejunjian@medmail．com．cn