邱 紅，邢繼成，朱月蓉，王 冰

(南京解放軍第八一醫(yī)院生化科，江蘇南京210002)

重組腺病毒Ad－HGF－h(huán)IL10基因治療大鼠肝纖維化

邱 紅*，邢繼成，朱月蓉，王 冰

(南京解放軍第八一醫(yī)院生化科，江蘇南京210002)

目的 探討人IL-10和HGF雙表達的重組腺病毒hIL10-HGF對大鼠肝纖維化的治療效果，以期為肝纖維化的基因治療提供實驗基礎(chǔ)。方法 建立SD大鼠肝纖維化模型后，將1.5×108PFU的Ad-HGF、Ad-hIL10和Ad-HGF-hIL10經(jīng)尾靜脈注射入大鼠體內(nèi)，模型組和對照組注射同劑量的0.9%氯化鈉注射液。第15天心臟采血，檢測血清的肝功能指標(biāo)，并取肝組織做HE染色，觀察各組大鼠肝臟的病理形態(tài)。結(jié)果 與模型組大鼠相比，治療組大鼠的肝組織損傷程度減輕，匯管區(qū)看不到明顯的纖維增生。各治療組的TBIL、ALT、AST顯著低于模型組(P＜0.01)，而ALB顯著升高(P＜0.01)，肝功能得到了明顯的改善，而Ad-HGF-hIL10雙基因治療組與Ad-HGF、Ad-hIL-10單基因治療組相比，ALT、AST顯著降低(P＜0.05)，白球比(0.83±0.11)與其他兩個單基因治療組Ad-HGF(0.74±0.05)和Ad-hIL-10(0.73±0.05)相比顯著上升(P＜0.01)。結(jié)論 用HGF和hIL-10雙基因的腺病毒載體治療大鼠肝纖維化，肝功能的改善效果明顯優(yōu)于單基因治療組。

肝纖維化;腺病毒;肝細胞生長因子;白細胞介素10;基因治療

肝炎、肝炎后肝硬化和肝癌嚴重危害人類健康，而絕大多數(shù)晚期病例尚缺乏有效治療手段。通過基因治療手段來預(yù)防和減輕肝損傷是近年來人們研究的一個新方向。肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)被認為是最強的肝再生促進劑，是一種具有多功能的生物大分子，它有強效的抗肝炎、促肝再生作用［1］。IL-10是一個多效性細胞因子，具有廣泛的生物學(xué)作用。研究表明內(nèi)源性IL-10對肝細胞具有保護作用，而且給予外源性IL-10也顯示了明顯的抗肝細胞損傷作用［2－3］。本研究將重組腺病毒通過尾靜脈注射入肝纖維化模型大鼠體內(nèi)，研究其對大鼠肝纖維化的治療作用，以期為肝硬化的基因治療提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物:清潔級雄性SD大鼠85只，8～10周，體質(zhì)量234～285 g，購自浙江省實驗動物中心南京代理處［SCXK(浙)20080033］。

1.1.2 質(zhì)粒、藥物和試劑:攜帶人肝細胞生長因子和白細胞介素-10基因的重組腺病毒Ad-HGF、AdhIL10和Ad-HGF-hIL10均由本實驗室構(gòu)建［4］，苯巴比妥鈉(100 mg/支)(上海新亞藥業(yè)有限公司)，四氯化碳(AR)(南京晟為諾生物科技有限公司)，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)試劑盒(煙臺澳斯邦生物工程有限公司)，總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)試劑盒(南京澳林生物科技有限公司)，總膽紅素(TBIL)試劑盒(日本和光純藥工業(yè)株式會社)，福臨門葵花籽油，食用白酒(乙醇體積分數(shù)52%)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備及分組:隨機抽取14只大鼠作為正常對照組，71只大鼠作為模型組，采用四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)法制備肝纖維化模型。模型制備分為兩期:誘導(dǎo)期和成模期。誘導(dǎo)期:實驗動物在誘導(dǎo)前以苯巴比妥鈉(350 mg/L)溶液作為大鼠的唯一用水，時間為1周，飼料使用普通大鼠飼料。成模期:實驗組:按0.5 mL/100 g劑量予以腹腔注射50%CCl4中性菜籽油溶液，每周2次連續(xù)4周，同時以10%乙醇水(由上述食用白酒加蒸餾水配制)為其唯一用水。第5周開始改為30%乙醇溶液為其唯一用水至實驗結(jié)束。對照組按0.3 mL/100 g予以腹腔注射0.9%氯化鈉注射液，每周2次，給予普通飲水和飼料，頻度及劑量同實驗組。時間共計10周，末次給藥后7 d，隨機取模型組和對照組各3只大鼠，心臟采血取血清檢測 ALT、AST、TP、ALB 和TBIL，取肝組織做HE染色的石蠟切片，觀察大鼠肝臟病理形態(tài)變化。

1.2.2 Ad-HGF、Ad-hIL10和 Ad-HGF-hIL10對肝纖維化的治療作用:隨機抽取肝硬化大鼠60只隨機分為4組，每組15只，分別為Ad-HGF治療組、Ad-hIL10治療組、Ad-HGF-hIL10治療組和模型組;對照組11只。治療組大鼠通過尾靜脈分別注射Ad-HGF、AdhIL10、Ad-HGF-hIL10 各300 μL 5 ×108PFU/mL，同樣方法給模型組和對照組注射同劑量的0.9%氯化鈉注射液，隔兩日給藥1次，給藥15 d后，采集所有大鼠的心臟血，分離血清，在日立7600生化儀上檢測 ALT、AST、TP、ALB 和 TBIL，并取肝組織做 HE 染色，觀察5組大鼠肝臟的病理形態(tài)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)以均數(shù) ±標(biāo)準差(±s)表示，采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肝纖維化模型的制備

成模61只，成模率85.9%。模型組大鼠的ALT、AST和TBIL高于正常，TP、ALB低于正常。肝臟病理學(xué)檢查:模型組大鼠的肝臟明顯腫大，邊緣鈍，質(zhì)韌;在光鏡下可見有細胞空泡壞死，有較多的中性粒細胞和淋巴細胞浸潤，匯管區(qū)成纖維細胞增多，纖維組織增生(圖1B)，對照組大鼠則無上述病變(圖1A)。

2.2 各組大鼠血清肝功能指標(biāo)

圖1 肝纖維化大鼠肝臟形態(tài)學(xué)改變Fig 1 Morphological changing of hepatic fibrosis(×400)

模型組與對照組比較，TBIL、ALT、AST明顯升高，ALB明顯降低(P＜0.01);治療組中，各組的TBIL、ALT、AST比模型組明顯降低(P＜0.01)，ALB顯著升高(P＜0.01);Ad-HGF-hIL10治療組與Ad-HGF、Ad-hIL-10治療組相比，ALT、AST 顯著降低(P＜0.05)，Ad-HGF-hIL10治療組的白球比與其他兩個單基因治療組相比顯著上升(P＜0.01)(表1)。

2.3 病理學(xué)變化

與模型組大鼠相比，治療組大鼠的肝細胞空泡變性程度減輕，數(shù)量減少;未見有中性粒細胞浸潤，僅見少量的淋巴細胞;肝細胞水腫吸收，炎性反應(yīng)明顯好轉(zhuǎn)，纖維組織減少(圖2)。

3 討論

圖2 各組大鼠治療后的肝臟形態(tài)學(xué)變化Fig 2 Morphological changing of rats'liver after therapy(×400)

肝細胞生長因子是一種具有多種生物學(xué)作用的實效分子，具有促有絲分裂、動力產(chǎn)生、細胞成形和腫瘤抑制等多種活性，同時也能刺激蛋白質(zhì)的合成，實驗表明［5－6］，HGF是肝細胞生長和 DNA 合成最強大的刺激劑，HGF通過旁分泌和自分泌機制啟動肝臟再生，刺激肝細胞的生長。在肝纖維化的過程中，HGF主要通過抑制肝成纖維細胞的生長和信號傳導(dǎo)，從而發(fā)揮抗肝纖維化的作用。

人IL-10主要通過具有高度親和力的IL-10受體發(fā)揮作用，其生物學(xué)作用廣泛，主要作用為抑制炎性反應(yīng)和抑制多種基因轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn)IL-10在控制局部炎性反應(yīng)特性上對肝臟起保護作用，并通過抑制炎性介質(zhì)的釋放、核因子κB活性等途徑阻止肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展，它可通過抑制HSC的功能及促進HSC發(fā)生凋亡而發(fā)揮抗纖維化作用，還可直接減少膠原形成及增加膠原酶，在肝ECM重建中發(fā)揮重要角色，另外，IL-10通過減少TGF-β1分泌而間接限制纖維化形成，具有潛在的強大抗肝纖維化作用［7］。目前多項研究結(jié)果已證實，HGF和IL-10有望成為抗肝纖維化治療的新靶點，但各項研究均集中于兩者各自的抗纖維化作用，將兩者基因融合后的抗肝纖維化研究尚未見報道。

表1 各組的肝功能指標(biāo)Table 1 Liver function index of different groups(x— ±s)

本研究結(jié)果顯示，給予 Ad-HGF、AdIL-10、Ad-HGF-hIL10治療均使已形成肝纖維化的大鼠肝臟病變顯著改善，無論從匯管區(qū)成纖維細胞的數(shù)量和纖維組織的層次還是退行性變的肝細胞數(shù)量和程度都可以看到纖維化程度的明顯減輕。各治療組的肝功能指標(biāo)與模型組相比，TBIL、ALT、AST明顯降低，ALB顯著升高，說明肝功能得到了明顯的改善，而Ad-HGF-hIL10雙基因治療組與Ad-HGF、Ad-hIL-10單基因治療組相比，ALT、AST顯著降低，白球比與其他兩個單基因治療組相比顯著上升，肝功能的改善效果明顯優(yōu)于單基因治療組。表明用雙基因的腺病毒載體治療肝纖維化大鼠，HGF和hIL-10在大鼠肝纖維化的改善過程中發(fā)揮了協(xié)同作用。除此之外，γ-干擾素(γ-IFN)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)抗體、轉(zhuǎn)化生長因子-α(TGF-α)抗體等細胞因子也被證實具有抗肝纖維化作用［8－9］，探索多基因聯(lián)合和尋找新的目的基因治療肝纖維化預(yù)期將獲得更為顯著的臨床效果。

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Gene therapy for rat hepatic fibrosis with recombinant adenovirus vector carrying HGF and hIL10

QIU Hong*，XING Ji-cheng，ZHU Yue-rong，WANG Bing

(Dept．of Biochemistry，PLA 81 Hospital，Nanjing 210002，China)

ObjectiveTo investigate the therapeutic effect of the recombinant adenovirus vector carrying hepatocyte growth factor(HGF)and human interleukin-10(hIL10)，Ad-HGF-hIL10，on CCl4-induced hepatic fibrosis in rats．MethodsHepatic fibrosis model was established with CCl4in SD rats，and a total of 58 rats were randomly divided into 4 groups．Ad-HGF-hIL10，Ad-HGF and Ad-hIL10 were injected into the tail vein of three testing groups respectively．Control group were injected with physiological saline．On the 15th day，blood samples were collected from rat heart，serum TBIL，ALT，AST，TP and ALB were measured．Liver biopsies were performed and microscoped．ResultsCompared with the model group，liver function of rats in the therapy group was obviously improved，while there is no obvious fibroplasia in the portal area．Compared with model group，the TBIL，ALT and AST level of the therapy group were obviously decreased(P＜0.01)and ALB level of the therapy group was obviously increased(P＜0.01)．The ALT and AST level of the Ad-HGF-hIL10 therapy group were much lower than that of the Ad-HGF and Ad-hIL10 therapy group(P＜0.05)，while the A/G value of the Ad-HGF-hIL10 therapy group is more higher than the Ad-HGF and Ad-hIL10 therapy groups(P＜0.01)．ConclusionsThe double-gene therapy group has better therapeutic effect than other single-gene therapy groups．

hepatic fibrosis;adenovirus;hepatocyte growth factor;interleukin-10;gene therapy

Q 784

A

1001-6325(2012)09-1049-04

2011－11－02

2011－12－09

南京軍區(qū)醫(yī)學(xué)科技創(chuàng)新經(jīng)費(07M041)

*通信作者(corresponding author):mapleqh@126．com