方月琴，郭娟寧，孫曉明，侯一平，顧 準

(1.江蘇健雄職業(yè)技術學院生物與化學工程系，江蘇蘇州215411;2.新加坡國家心臟中心研發(fā)部門，新加坡168752;3.新鄉(xiāng)醫(yī)學院法醫(yī)學系，河南新鄉(xiāng)453003;4.四川大學華西基礎醫(yī)學與法醫(yī)學院，四川成都610041)

高效制備人誘導多能干細胞并誘導分化為心肌細胞

方月琴1，2，郭娟寧3，孫曉明2，侯一平4，顧 準1*

(1.江蘇健雄職業(yè)技術學院生物與化學工程系，江蘇蘇州215411;2.新加坡國家心臟中心研發(fā)部門，新加坡168752;3.新鄉(xiāng)醫(yī)學院法醫(yī)學系，河南新鄉(xiāng)453003;4.四川大學華西基礎醫(yī)學與法醫(yī)學院，四川成都610041)

目的 提高人誘導性多能干細胞(hiPSC)轉化效率，縮短其產生周期，并避免引入異源基因。方法 利用GP2-293反轉錄病毒包裝系統(tǒng)對人包皮成纖維細胞(HFFs)進行轉化，引入小分子物質，并對類胚胎干細胞(ESC)克隆進行獨立培養(yǎng)，檢測標記蛋白，定向誘導分化能力和核型分析。結果 HFFs經轉化后，20 d出現(xiàn)形態(tài)與ESC克隆相似的hiPSC，比經典法縮短了10 d，效率提高約12倍。它們與ESC同樣表達標記蛋白;體外成功定向分化為心肌細胞。核型分析表明該hiPSC染色體核型正常。結論 建立穩(wěn)定的轉化效率高、周期短的hiPSC生成體系，并成功誘導分化成心肌細胞，為心血管疾病的模型構建和臨床研究提供實驗基礎。

誘導性多能干細胞;轉化效率;形成周期;心肌細胞;分化

誘導性多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPSC)是體細胞經過轉化因子重編程得到的、與胚胎干細胞(embryonic stem cells，ESC)具有相似的形態(tài)、功能特性的多能干細胞［1－2］，是疾病模型研究的良好載體，并為臨床進行自體干細胞移植提供選擇［3］。本實驗采用 GP2-293細胞包裝OCT4、SOX2、KLF4和C-MYC4種因子的反轉錄病毒感染體細胞，在轉化過程中加入 SB431542、PD0325901和Thiazovivin 3種小分子物質，以建立快速、高效iPSC誘導方法，并探討其在體外定向誘導分化為心肌細胞的潛能，為構建心血管疾病模型以及自體干細胞臨床治療提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

HFFs(新生兒包皮來源)(ATCC公司);GP2-293細胞(Clontech公司);小鼠胚胎成纖維細胞MEF(Chemicon公司);所有細胞培養(yǎng)基(Invitrogen公司)。上述細胞培養(yǎng)基成分為DMEM中含10%胎牛血清和1×L-谷氨酰胺。聚凝胺和絲裂霉素C(Sigma公司)，qRT-PCR試劑盒和細胞轉染試劑盒(Clontech公司)，SB431542、PD0325901和 Thiazovivin(Stemgent公司)。

人胚胎干細胞hESC9(WiCell)，培養(yǎng)基為hESC培養(yǎng)液(DMEM:F12，20%KOSR，1×非必需氨基酸，1 × L-谷氨酰胺，0.11 mol/L 2-巰基乙醇，10 μg/L重組堿性成纖維生長因子bFGF)。

1.2 質粒

質 粒 pMXs-OCT4、pMXs-SOX2、pMXs-KLF4、pMXs-C-MYC(Addgene公司);pMXs-GFP的準備:以eGFP質粒(新加坡科學研究院試驗性治療中心Dr.William Sun實驗室提供)為PCR模板，設計引物eGFP前引物:5'-CGGGAATTCGCCCTTCACCATGGT GAGCAAGGGCGAGGA-3';eGFP后引物:5'-CCGG AATTCTTACTTGTACAGCTCGTCCA-3'，引物兩端引入EcoRⅠ酶切位點;PCR產物經EcoRⅠ酶進行酶切;同時用該酶切除pMXs-OCT4中OCT4基因以獲得pMXs空載體，再將兩者進行連接、轉化。經酶切鑒定片段插入、測序明確序列及方向后，得到pMXs-GFP。大量抽提質粒于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 人誘導性多能干細胞(human induced pluri-potent stem cells，hiPSC)生成過程

先準備OCT4、SOX2、KLF4和C-MYC4種轉化因子的反轉錄病毒。在6 cm細胞培養(yǎng)皿上培養(yǎng)1×106個 GP2-293細胞，第 2天觀察細胞，到達70%～80%匯合時利用磷酸鈣法細胞轉染試劑盒進行轉染，次日早上換液。同時在 6孔板上培養(yǎng)105/孔人包皮成纖維細胞(human foreskin fibroblast cells，HFFs)(0 d)。轉染48 h后收集GP2-293細胞上清液，經0.45 μm過濾器進行過濾，留200 μL作病毒滴度檢測(反轉錄病毒qRT-PCR滴度檢測試劑盒);混合4種病毒液，加入終濃度為8 μg/L的聚凝胺。在培養(yǎng)HFFs的6孔板每孔加入8 mL病毒混合液，感染8 h后吸去病毒液，換成2 mL新鮮10%胎牛血清培養(yǎng)液(1 d)。GP2-293細胞轉染72 h后再次收集病毒，對HFFs進行2次感染，8 h后換成4 mL 10% 胎牛血清培養(yǎng)基(2 d)。5 d時對HFFs進行換液;同時先在6 cm培養(yǎng)皿加2 mL明膠，37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱放置半小時以上，吸去明膠后，加絲裂霉素C處理過的飼養(yǎng)層細胞MEF，106/6 cm培養(yǎng)皿。6 d將病毒感染的HFFs經胰蛋白酶消化后轉移到5 d準備的MEF上，105/6 cm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)過夜。第2天將 MEF培養(yǎng)液換成 hESC培養(yǎng)液，其中含10 μg/L的 bFGF 和濃度分別為2 μmol/L SB431542、0.5 μmol/L PD0325901 和 0.5 μmol/L Thiazovivin的3種小分子物質。隔天換1次培養(yǎng)液直至13 d出現(xiàn)小細胞團后，換成不含小分子物質的hESC培養(yǎng)液，直至克隆足夠大。21 d左右將形狀類似hESC的克隆，用針頭切下來后培養(yǎng)到鋪有MEF的器官培養(yǎng)皿(organ culture dish，OCD)上，1個克隆轉移至1個OCD，分別標記。待克隆長大后再進行傳代，同傳統(tǒng)hESC培養(yǎng)。

1.4 堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)染色和免疫細胞化學熒光染色

利用ALP測定試劑盒(Vector Laboratories公司)，根據(jù)說明書對iPSC和hESC克隆進行ALP染色。免疫細胞化學熒光染色操作:細胞在4%多聚甲醛室溫固定10 min，PBS洗滌2次，5%胎牛血清和0.1%Triton X-100室溫封閉15 min，之后加入一抗，4℃孵育過夜。一抗有抗OCT4(1∶50，Abcam公司)，SSEA4(1∶500，Chemicon 公 司)，TRA-1-81(1∶100，Santa Cruz公司)和 TRA-1-60(1∶100，Santa Cruz公司)。之后PBS清洗2次，加入二抗室溫孵育1 h。二抗為 Alexa flour 555-標記抗小鼠 IgG(1∶1 000，Invitrogen 公司)。胞核染色是 DAPI(1∶1 000，Invitrogen 公司)。

1.5 擬胚體(embryonic body，EB)形成與誘導分化成心肌細胞

將iPS克隆在10 cm培養(yǎng)皿中進行擴大培養(yǎng)，至85%～90%匯合，轉移至6孔低黏附板上進行擬胚體(EB)形成。培養(yǎng)液為EB20培養(yǎng)液(DMEM:F12中含20% 胎牛血清，1×非必需氨基酸，1×L-谷氨酰胺，0.11 mmol/L 2-巰基乙醇)。一般2個10 cm培養(yǎng)皿中85%～90%匯合的iPSC可以轉移至一個6孔板上。37℃培養(yǎng)過夜后，將EB20培養(yǎng)液換成CARM心肌細胞誘導培養(yǎng)液(DMEM中含1×ST混合液，1×非必需氨基酸，1×L-谷氨酰胺，0.11 mmol/L 2-巰基乙醇)，1～2周內出現(xiàn)搏動的心肌細胞團。

將搏動的心肌細胞團從6孔板中小心取出，培養(yǎng)于經明膠處理過的多電極陣列(multi-electrode array，MEA)中央，待其附著固定后，用MEA信號記錄儀對心肌細胞生理信號進行記錄。

1.6 染色體核型分析

將待分析的iPSC細胞系R1.9、R1.15和hESC培養(yǎng)于鋪有MEF的6 cm細胞培養(yǎng)皿上，待50% ～90%匯合時，交由新加坡KK醫(yī)院產前篩查實驗室分析。

2 結果

2.1 pMXs-GFP質粒的構建

pMXs-GFP質粒轉染進入GP2-293細胞后，熒光倒置顯微鏡下觀察顯綠色熒光，轉染效率在80%左右。

經pMXs-GFP病毒感染的人包皮成纖維細胞(human foreskin fibroblast cells，HFFs)，感染病毒3 d后熒光下可見80%以上HFFs都攜帶GFP。

2.2 反轉錄病毒滴度測定

按照反轉錄病毒qRT-PCR滴度檢測試劑盒操作說明，所得數(shù)據(jù)進行標準曲線分析R2=0.9991。根據(jù)所得方程式計算4種病毒量，發(fā)現(xiàn)每種病毒滴度接近，約為2×109copies/mL。在進行感染時，6孔板中每種病毒加入相同的量，為2 mL/孔。

2.3 從HFFs制備hiPSC

iPSC制備過程和時間表如圖1A所示。一個6cm細胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)1×105病毒感染HFFs，21 d時約出現(xiàn)30個左右類似hESC的克隆，效率比經典方法高12倍。同時，iPSC形成周期從30 d縮短到20 d，節(jié)約了工作時間。

在MEF飼養(yǎng)層細胞上，iPSC與hESC克隆形態(tài)形態(tài)相似(圖1B)，呈圓形或橢圓形，與MEF之間有明顯而清晰的邊界，克隆內細胞排列有序而緊密。一般7 d傳代。

2.4 ALP與免疫熒光染色結果

除ALP之外，其他干細胞特征性標志也做了檢測。由圖2可知R1.9與hESC同樣都表達了這些干細胞標志性蛋白質。

2.5 hiPCS和hESC體外誘導分化成的心肌細胞

iPSC和hESC首先懸浮培養(yǎng)成球形EB，然后經過2周左右誘導分化，形成具有節(jié)律性搏動的心肌細胞團塊，形態(tài)如圖2A所示。將心肌細胞團置于MEA上記錄心肌電生理情況 (圖2B)，從hESC分化得到的心肌細胞兩次搏動之間間隔為826 ms，幅度為119 μV，心率為73次/min;從hiPS穩(wěn)定細胞系R1.19分化得到的心肌細胞兩次搏動之間間隔為820 ms，幅度為117 μV，心率為70次/min。

2.6 核型分析結果

hESC購自美國威斯康星國際干細胞庫，核型為46，XX;iPSC 來源細胞是 HFFs，核型為 46，XY。新加坡KK婦女與兒童醫(yī)院產前篩查實驗室檢測結果均為正常核型，并與預期相符。

3 討論

體細胞經4種轉錄因子作用可轉變?yōu)閕PSC，它們不但擁有正常核型，還具有與ESC相似的細胞表面標記及向3個胚層細胞發(fā)育的潛能［1］，從而在一定程度上規(guī)避了hESC運用所引起的倫理學問題［2］。近年來全球掀起了iPS研究高潮，從iPS產生機制和疾病相關iPS方面展開了廣泛而深刻的研究，以期早日為臨床醫(yī)學服務［4－5］。

圖1 iPSC的制備過程和iPSC與hESC克隆標記物鑒定Fig 1 Induction process for iPSC and specific markers detection

iPSC最早是利用PLAT-E細胞制備反轉錄病毒，向成體細胞中轉入OCT4、SOX2、KLF4和C-MYC4種轉化因子獲得［6］。但hiPSC轉化效率低(10個iPS克隆/5×104HFFs)，所需周期長(30 d)，亟需提高轉化效率并縮短實驗周期。研究發(fā)現(xiàn)在轉化過程中加入3種小分子化合物SB431542、PD0325901和Thiazovivin可大幅提高轉化效率，并縮短重編程周期［7］。但是該過程需先將鼠Slc7a受體通過慢病毒轉入HFFs，再用4種轉錄因子的反轉錄病毒，對攜帶Slc7a受體的HFFs進行轉化。該過程需兩步感染，雖提高了iPSC的轉化效率，但同時引入了異源基因鼠Slc7a受體。

圖2 hiPSC和hESC誘導分化為心肌細胞Fig 2 Cardiomyocytes from hESC and iPSC

本研究通過GP2-293細胞包裝4種轉化因子。GP2-293體系包裝所得病毒能夠直接感染人分裂期細胞，無需在人體細胞中導入鼠源基因Slc7a受體，也省略了慢病毒包裝與感染過程。故可避免在目的細胞中引入異源基因，并在一定程度上降低了實驗風險。

在HFFs向iPSC轉化過程中，細胞形態(tài)、極性、細胞與細胞間關系都發(fā)生了巨大變化。此過程中，細胞開始表達上皮細胞標記蛋白，由此推測能夠促進間質向上皮轉化的因子可促進iPSC的生成，如TGFβ通道拮抗劑SB431542。此外，MEK通路是體細胞的細胞周期進程所必需的，而非ESC所需。研究也表明抑制MEK-ERK通路對于iPSC產生過程也有很重要的促進作用，而PD0325901為MEK抑制劑［8］。Thiazovivin是促細胞存活分子，以上3種物質合用能夠提高轉化效率，縮短 iPSC形成周期［7］。因此在本實驗中也引入了這3種物質，提高了轉化效率。

本研究建立了一種安全有效的iPSC制備方法，并體外誘導分化為心肌細胞。最近報道用較少的因子［9］即可獲得轉化，或是將體細胞直接誘導成心肌細胞［10］或神經細胞［1］，避開轉化過程，為疾病模型構建和自體細胞治療節(jié)約了時間。本研究將繼續(xù)探討用更優(yōu)化的方法進行心血管疾病特異性iPS細胞系構建及自體細胞治療的嘗試。

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Induction of human fibroblast cells to pluripotent stem cells and differentiation into cardiomyocytes

FANG Yue-qin1，2，GUO Juan-ning3，SUN Xiao-ming2，HOU Yi-ping4，GU Zhun1*

(1.Dept．of Biological and Chemical Engineering，Chien-Shiung Institute of Technology，Suzhou 215411;2.Research and Development Unit，National Heart Center，168752 Singapore;3.Dept．of Medical School，Xinxiang Medical University，Xinxiang 453003;4.Sichuan University，Chengdu 610041，China)

ObjectiveTo increase the transduction efficiency of hiPSC formation，decrease the time schedule and avoid the possibility of exogene introduction．MethodsHuman fibroblast cells were infected by retrovirus with four factors．During transduction，small molecules were added into hESC medium，until iPSC colonies grew big enough to be transferred．The stable iPSC colonies were detected by the expression of ESC protein markers，cardiomyocytes differentiation and karotyping analysis．ResultsThe reprogramming period was shortened by 10 days with 12 times higher efficiency．The iPSC shared similar protein expression level with hESC．Both iPSC and hESC were differentiated into cardiomyocytes successfully with similar MEA data and both showed normal karotyping results．ConclusionsThe established iPSC reprogramming system is efficient and time-saving for providing research model for cardiovascular disease modeling and clinical study．

induced pluripotent stem cells;transduction efficiency;time schedule;cardiomyocytes;differentiation

R 318.11

A

1001-6325(2012)09-1030-06

2011－06－13

2011－12－30

國家自然科學基金(81072510);河南省教育廳課題(2008A340001)

*通信作者(corresponding author):yueqinfang@yahoo．com．cn

志謝:感謝新加坡科學研究院試驗性治療中心William Sun博士提供eGFP質粒。