韋 艷，張海英，梁 鋼*

(1.武警廣西總隊醫(yī)院，廣西南寧530003;2.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西南寧530021)

5－FU誘導(dǎo)人肝細(xì)胞癌MDR的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究

韋 艷1，張海英2，梁 鋼2*

(1.武警廣西總隊醫(yī)院，廣西南寧530003;2.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西南寧530021)

目的 尋找與人肝細(xì)胞癌多藥耐藥相關(guān)的蛋白質(zhì)分子，為進(jìn)一步研究人肝細(xì)胞癌多藥耐藥機(jī)制提供依據(jù)。方法 體外培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞Bel-7402及其耐5-氟尿嘧啶(5-FU)細(xì)胞Bel-FU，MTT法檢測Bel-FU的多藥耐藥性，雙向凝膠電泳技術(shù)分析細(xì)胞Bel-7402與Bel-FU之間的差異表達(dá)蛋白，經(jīng)MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜鑒定。Western blot驗證2-DE及質(zhì)譜的檢測結(jié)果。結(jié)果 與Bel-7402比較，Bel-FU中有24個蛋白表達(dá)上調(diào)，其中包括FAK、TM3、ORP150、CRT、hnRNP K、80K-H protein、EF-1-D、phosphoprotein 等，12 個蛋白表達(dá)下調(diào)。Western blot法檢測到蛋白FAK、CRT在Bel-FU中高表達(dá)，與2-DE結(jié)果一致。結(jié)論 通過建立人肝癌細(xì)胞Bel-7402及其耐5-氟尿嘧啶細(xì)胞Bel-FU的2-DE圖譜篩選了多藥耐藥相關(guān)的差異蛋白，為人肝細(xì)胞癌MDR的分子機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。

肝細(xì)胞癌;多藥耐藥;比較蛋白質(zhì)組學(xué);雙向凝膠電泳

目前化學(xué)藥物治療作為肝癌臨床治療主要手段之一，面臨的最大難題就是多藥耐藥［1］(multidrug resistance，MDR)，這是指腫瘤細(xì)胞對某一種藥物產(chǎn)生耐藥性后，該腫瘤細(xì)胞逐漸對那些結(jié)構(gòu)無關(guān)、作用靶點不同，甚至是未接觸過的、機(jī)制不同的抗腫瘤藥物也具有交叉耐藥性。腫瘤MDR的發(fā)生機(jī)制非常復(fù)雜，通常認(rèn)為是由一系列基因的失活與激活而導(dǎo)致的，然而從功能的角度上來看，無論是基因的突變還是轉(zhuǎn)錄及翻譯后的變化，其結(jié)果都導(dǎo)致基因表達(dá)產(chǎn)物的改變，從而改變了蛋白質(zhì)信號通路，因此有必要從蛋白質(zhì)整體水平來研究腫瘤細(xì)胞MDR。本研究基于比較腫瘤細(xì)胞、耐藥細(xì)胞之間蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，以發(fā)現(xiàn)相關(guān)的特異性蛋白，為揭示腫瘤MDR發(fā)生的分子機(jī)制、防治以及靶點的發(fā)現(xiàn)提供科學(xué)依據(jù)，對新藥開發(fā)也更具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞:人肝癌細(xì)胞系Bel-7402(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)。

1.1.2 試劑:5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)、長春新堿(vincristin，VCR)和阿霉素(adriamycin，ADM)(浙江海正藥業(yè)公司)，柔紅霉素(Daunorubicin，DAN)和阿糖胞苷(cytarabine)(上海華聯(lián)制藥有限公司)，尿素、硫脲、CHAPS和DTT(Amresco公司)，IPG 緩沖液、IPG 膠條(pH4-7，24 cm，GE 公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，置37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況，0.25% 胰蛋白酶消化傳代，Bel-FU細(xì)胞培養(yǎng)時加入20 mg/L 5-氟尿嘧啶維持其多藥耐藥性，實驗前停1周，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。

1.2.2 甲基四唑藍(lán)(MTT)法測定肝癌耐藥細(xì)胞Bel-FU多藥耐藥性:實驗分親本細(xì)胞和耐藥細(xì)胞兩組，每組設(shè)空白對照組(只加培養(yǎng)液)，陰性對照組(只加細(xì)胞)，抗癌藥物組。取單細(xì)胞懸液1×105個/mL種于同一 96孔板中，每孔100 μL置37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。分別加入不同濃度的抗癌藥物5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、阿霉素、長春堿，以上藥品均以注射用0.9%氯化鈉注射液配成母液，使用時用培養(yǎng)液配成一系列的稀釋液，終體積至200 μL。培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μL MTT(5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，充分溶解藍(lán)紫色結(jié)晶，酶標(biāo)儀選擇波長492 nm測吸光度值，實驗不同日重復(fù)3次取均數(shù)。計算細(xì)胞抑制率(inhibitive rate，IR)=(陰性對照組吸光度值－抗癌藥物吸光度值)/陰性對照組吸光度值×100%，LOGIT軟件計算求得IC50(50%inhibiting concentration，半抑制濃度)。耐藥指數(shù)(resistance index，RI)=耐藥細(xì)胞株IC50/親本細(xì)胞株IC50。

1.2.3 細(xì)胞總蛋白的提取:取對數(shù)生長期細(xì)胞，用PBS清洗3次，盡量讓培養(yǎng)瓶中不要殘留PBS。根據(jù)培養(yǎng)瓶底表面積的大小加入蛋白裂解液(瓶底面積每1 cm2加入10 μL蛋白裂解液)。讓裂解液充分與細(xì)胞接觸，靜置冰上裂解40 min，收集瓶中的裂解液，渦旋振蕩5 s×2次，4℃ 30 000 r/min離心50 min，取上清，蛋白質(zhì)定量試劑盒 2D Quantifi2cation kit定量。

1.2.4 雙向凝膠電泳(2-DE)及差異蛋白質(zhì)點的質(zhì)譜鑒定:取樣品蛋白加入IPG緩沖液2.5μL，再加入水化儲存液使總體積至450 μL。設(shè)置IPGphor儀器的運(yùn)行參數(shù)。程序結(jié)束后取出膠條進(jìn)行平衡，IPG膠條平衡2次。裝好灌模具，灌膠。將平衡好的膠條小心的放置于膠面上并輕壓使膠條與膠面充分接觸，并覆蓋2 mL瓊脂糖溶液后開始電泳。硝酸銀染色程序如下:固定30 min，敏化30 min，漂洗5 min×3次，銀染20 min，漂洗1 min×2次;顯色后加入適量冰醋酸終止。染色后的凝膠經(jīng)ImageScanner掃描儀掃描獲得蛋白質(zhì)點圖譜，所得圖譜用ImageMaster 2-DE Platinum 5.0軟件分析。圖像分析過程包括背景消減、獲取蛋白質(zhì)斑點位置坐標(biāo)等的校正，然后分別將同種細(xì)胞3次電泳所得的蛋白質(zhì)點圖譜在軟件中創(chuàng)建平均膠，以其中一組的平均膠為參照膠與另一組的平均膠進(jìn)行匹配，尋找兩種細(xì)胞間差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點。蛋白點灰度值差異達(dá)到2.5倍以上認(rèn)定為差異蛋白。將差異蛋白質(zhì)點切下，進(jìn)行酶解，提取酶解的肽段后脫鹽，進(jìn)行MALDI-TOF-MS檢測，通過rNCBI數(shù)據(jù)庫獲取蛋白質(zhì)點的信息。

1.2.5 Western blot法檢測FAK、CRT蛋白表達(dá):消化收集細(xì)胞，加入適量細(xì)胞裂解液，冰上放置30 min，10 000×g離心40 min取上清，bradford 法測定提取蛋白的濃度。進(jìn)行十二烷基磺酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離膠濃度為7%，濃縮膠濃度為4%。采用濕法轉(zhuǎn)膜，200 mm/mol恒流，轉(zhuǎn)移時間2 h。5%BSA封閉4℃過夜，與一抗、二抗雜交反應(yīng)后，過氧化物酶HRP-ECL顯影，掃描后應(yīng)用quantity-one軟件分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

MTT法中數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，藥物對細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度IC50值根據(jù)LOGIT計算軟件確定。組間均數(shù)的比較采用t檢驗，采用SPSS16.0軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 肝癌耐藥細(xì)胞多藥耐藥性

耐藥細(xì)胞Bel-FU對5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、長春新堿、阿霉素和柔紅霉素的耐藥指數(shù)分別為89.6、3.9、37.1、15.0 和3.7 倍(P＜0.05)(表1)。

表1 Bel-FU對各種抗癌藥物的耐藥指數(shù)Table 1 Resistance index of Bel-FU to different anticancer drugs(±s，n=3)

表1 Bel-FU對各種抗癌藥物的耐藥指數(shù)Table 1 Resistance index of Bel-FU to different anticancer drugs(±s，n=3)

*P ＜0.05 compared with Bel-7402．

drug IC50(μmol/L)RI Bel-7402 Bel-FU 5-FU 36.21±4.80 3243.52±67.52*89.6 cytarabine 3.72±0.54 14.51±2.19* 3.9 VCR 0.74±0.13 27.45±2.19* 37.1 ADM 2.20±1.03 33.08±6.16* 15.0 DAN 1.23±0.13 4.55±0.89*3.7

2.2 2-DE凝膠圖譜

圖1為細(xì)胞Bel-7402與Bel-FU總蛋白雙向電泳凝膠圖以及之間的36個差異蛋白點。與Bel-7402比較，24個蛋白點在Bel-FU上調(diào)，分別編號為1 至 17、23、31、32、33、34、35、36 和 12 個蛋白點在Bel-FU 下調(diào)，分別編號為 18、19、20、21、22、24、25、26、27、28、29和 30。圖2 為 Bel-7402 與 Bel-FU 之間部分差異蛋白點的放大圖。

2.3 差異表達(dá)蛋白質(zhì)的質(zhì)譜檢測選結(jié)果

選取在細(xì)胞Bel-FU中高表達(dá)的部分差異蛋白點進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜鑒定(編號為2、3、5、8、9、10、12 和15 的8 個蛋白質(zhì)點)。通過搜索NCBInr數(shù)據(jù)庫，獲取各蛋白質(zhì)點信息(表2)。

表2 各差異蛋白質(zhì)點信息Table 2 Information of the differential expression protein

2.4 Western blot檢測蛋白FAK、CRT的表達(dá)

敏感細(xì)胞Bel-7402與耐藥細(xì)胞Bel-FU中蛋白FAK、CRT表達(dá)變化情況(圖3)。各組細(xì)胞樣品蛋白中 FAK/β-actin、CRT/β-actin 比值(表3)。

圖3 FAK、CRT蛋白表達(dá)區(qū)帶Fig 3 The Western blot of FAK and CRT

表3 FAK、CRT蛋白表達(dá)變化Table 3 The differential expression of FAK and CRT(±s，n=3)

表3 FAK、CRT蛋白表達(dá)變化Table 3 The differential expression of FAK and CRT(±s，n=3)

*P＜0.05 compared with Bel-FU．

ratio Bel-7402 Bel-FU FAK/β-actin 0.550 ±0.031*0.969±0.064 1.030±0.071 CRT/β-actin 0.659 ±0.024*

3 討論

MTT實驗顯示5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)的耐藥細(xì)胞對5-氟尿嘧啶具明顯抗藥性，對長春新堿、阿霉素有交叉抗藥性，對阿糖胞苷、柔紅霉素的抗藥性較小。通過對兩組雙細(xì)胞樣品雙向凝膠電泳蛋白質(zhì)圖譜進(jìn)行分析比較，在pH 4～7范圍的凝膠圖譜里，Bel-7402組與Bel-FU組之間的差異蛋白中，經(jīng)MALDITOF MS鑒定了8個在Bel-FU細(xì)胞中高表達(dá)的蛋白，分別為:黏著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)、低氧上調(diào)蛋白 1(hypoxia up-regulated 1，HYOU1 protein)、葡萄糖苷酶Ⅱ(glucosidaseⅡ)、鈣網(wǎng)蛋白(calreticulin，CRT)、蛋白激酶C底物80K-H蛋白(80K-H protein)、原肌球調(diào)節(jié)蛋白(tropomodulin 3)、延伸因子1(elongation factor-1-delta)、異源核糖核蛋白K(heterogeneous nuclear ribonucleo protein K，hnRNP K)，經(jīng) Western blot驗證 FAK、CRT在耐藥細(xì)胞中呈現(xiàn)出高表達(dá)。這些表達(dá)量上調(diào)的蛋白分子功能主要與細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞周期、增殖、凋亡、能量代謝及核酸合成與代謝相關(guān)。

耐藥細(xì)胞中FAK的高表達(dá)提示抑制化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［2－3］。細(xì)胞間黏附和群集是產(chǎn)生耐藥的原因之一，已有研究證實反義FAK寡核苷酸可有效地干預(yù)細(xì)胞黏附，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，而這些都可能影響到化療藥物的敏感性［4］，以FAK為靶點的對抗細(xì)胞附性治療對腫瘤耐藥會有逆轉(zhuǎn)作用。在Bel-FU細(xì)胞中FAK上調(diào)倍數(shù)達(dá)到3倍以上，由此推測，F(xiàn)AK可能是5-FU誘導(dǎo)細(xì)胞耐藥的關(guān)鍵因子之一;HYOU1也稱為氧調(diào)節(jié)蛋白150(oxygen-regulated protein，ORP150)，其高表達(dá)提示耐藥可能是通過促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)從而對腫瘤細(xì)胞起到保護(hù)的作用來實現(xiàn)的。有研究發(fā)現(xiàn)［5］，人肝癌細(xì)胞中ORP150基因及蛋白表達(dá)均高于正常肝細(xì)胞中的表達(dá)量，經(jīng)反義RNA技術(shù)后肝細(xì)胞癌的凋亡明顯增加而侵襲性無改變，ORP150有望成為肝細(xì)胞癌MDR的治療靶點;葡萄糖苷酶Ⅱ作為胰島素作用通路上的調(diào)節(jié)酶，其活性升高不僅與糖尿病和胰島素抵抗有關(guān)，并且能與多種激素介導(dǎo)細(xì)胞代謝、增殖的信號通路調(diào)控，而這些信號通路的異常活躍與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展亦有密切關(guān)系，目前葡萄糖苷酶Ⅱ具體通過哪些細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了MDR還有待研究和探討。CRT是一種普遍存在且高度保守的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣結(jié)合蛋白，CRT通過調(diào)節(jié)腫瘤抗原的遞呈、抑制血管的生成而與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，有研究比較分析了肝癌患者、肝癌高危人群及正常人中蛋白質(zhì)的表達(dá)差異，結(jié)果前者血液中CRT及其裂解片段遠(yuǎn)高于后兩者［6］。在本實驗中，耐藥細(xì)胞中CRT的高表達(dá)量對MDR機(jī)制研究中具有重要的意義;蛋白激酶C底物80K-H蛋白的上調(diào)，多見于多囊性肝病，而實驗中發(fā)現(xiàn)其在耐藥細(xì)胞中高表達(dá)很可能預(yù)示細(xì)胞中蛋白激酶C含量的增加耐導(dǎo)致耐藥;原肌球蛋白(tropomyosin，TM)是通過穩(wěn)定肌動蛋白的狀態(tài)參與肌肉收縮的重要蛋白，在誘導(dǎo)細(xì)胞間質(zhì)的轉(zhuǎn)移以及細(xì)胞調(diào)亡中起重要作用。已有研究報道原肌球蛋白在腫瘤轉(zhuǎn)移和耐藥細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)，如:在人急性早幼粒細(xì)胞白血病維甲酸敏感細(xì)胞株和維甲酸耐藥細(xì)胞株的差異耐藥相關(guān)蛋白中，也發(fā)現(xiàn)原肌球蛋白在耐藥細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)的情況，提示了原肌球蛋白參與了腫瘤耐藥過程［7］。在肝癌轉(zhuǎn)移亞細(xì)胞中原肌球蛋白表達(dá)上調(diào)［8］，提示該蛋白在參與腫瘤轉(zhuǎn)移過程所起的重要作用，因此是否可以把原肌球蛋白作為篩選抗腫瘤藥和逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR劑的靶點將有待后期的繼續(xù)研究。hnRNP K屬于RNA結(jié)合蛋白亞家族的一種多功能蛋白分子，目前已有研究證實hnRNP K與乳腺癌、淋巴瘤等腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)［9－10］。并且發(fā)現(xiàn)DNA損傷后可引起hnRNPK作為轉(zhuǎn)錄激活因子，通過增強(qiáng)P53、C-MYC、EGR和BRCA1基因的表達(dá)［11］因此 hnRNPK可能通過激活腫瘤MDR相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄而產(chǎn)生耐藥。由此可見，由5-FU誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞MDR是通過多途徑多通道的機(jī)制實現(xiàn)的，篩選出的這些差異蛋白質(zhì)為今后的MDR深入研究提供了重要的依據(jù)。

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Comparative proteomics analysis of human hepatocellular carcinoma MDR induced by 5-FU

WEI Yan1，ZHANG Hai-ying2，LIANG Gang2*

(1.Guangxi Provincial Crops Hospital of Chinese People's Armed Police Force，Nanning 530003;2.Pharmacy College，Guangxi Medical University，Nanning 530021，China)

ObjectiveTo search the protein from human hepatocellular carcinoma MDR and provide evidence for the mechanism of hepatocellular carcinoma MDR．MethodsHuman hepatocellular carcinoma cell line Bel-7402 and 5-FU resistant cell line Bel-FU were cultured．The MDR of Bel-FU was detected by MTT assay，to screen the differential expression protein between Bel-7402 and Bel-FU by 2-DE and MALDI-TOF/TOF．ResultsCompared with those in Bel-7402，24 proteins were up-regulated in Bel-FU including FAK，TM3，ORP150，CRT，hnRNP K，80K-H protein，EF-1-D，phosphoprotein and so on，and 12 proteins were down-regulated．Western blot confirmed that FAK and CRT were up-regulated in Bel-FU，the results were in accordance with the results of 2-DE．ConclusionsThe differential expression protein between Bel-7402 and Bel-FU may support the study of molecule mechanism of MDR．

hepatocellular carcinoma;multidrug resistance;comparative proteomics;2-DE

R 966

A

1001-6325(2012)09-1015-06

2011－10－20

2011－12－28

國家自然科學(xué)基金(30760310);廣西地方性高發(fā)疾病防治研究重點實驗室基金(桂科能0842009-k6);廣西科學(xué)基金(桂科自0728113);廣西中醫(yī)藥研究院中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點實驗室開放課題基金(桂中重開0801)

*通信作者(corresponding author):Lianggang22@yahoo．com．cn