王慶才 李君山 井夫春 李 磊 魏 瑋 王 越

(泰山醫(yī)學院附屬泰山醫(yī)院消化內(nèi)一科，山東 泰安 271000)

胃癌是原發(fā)于胃部的一種常見的惡性腫瘤，由于病情發(fā)展快，早期診斷率低，中晚期患者治療效果有限，同時單純手術(shù)的療效差[1]。本實驗從臨床工作實際出發(fā)，選擇與胃癌密切相關(guān)的Stathmin，聯(lián)合應用免疫組化方法和RT-PCR技術(shù)，研究其在胃癌中的表達及其與臨床病理特征之間的關(guān)系，探討其在胃癌中所起的作用，有助于臨床了解胃癌病人判斷預后及指導術(shù)后化療藥物的選擇。

1 材料和方法

1.1 一般資料

收集泰安市中心醫(yī)院2008年1月～2008年6月間手術(shù)切除并經(jīng)病理證實、資料完整的胃癌組織標本及其癌旁組織標本各34例，術(shù)前均未接受放、化療，其中男22例，女12例，年齡32～75歲，平均(54.6±7.2)歲，所制切片按全國胃癌協(xié)作組標準由專職病理科醫(yī)師復檢，病理類型：高分化腺癌7例，中分化腺癌9例，低分化腺癌18例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者25例，無淋巴轉(zhuǎn)移者9例。TNM分期：I～II期12例、III～IV期22例，其中未浸透漿膜者6例，穿透漿膜者28例。

1.2 方法

1.2.1免疫組化方法

采用免疫組化SP法，切片常規(guī)脫蠟，微波修復抗原，滴加一抗(為兔IgG)，置于4°C冰箱中過夜。滴加生物素化二抗，DAB顯色，蘇木素復染，陰性對照片用PBS液替代一抗，雙盲法判定結(jié)果，細胞陽性染色為棕黃色顆粒沉淀。由兩名未參與實驗的病理科醫(yī)生協(xié)助免疫組化結(jié)果的判斷，顯微鏡下觀察染色結(jié)果。每例標本選擇5個有代表性的高倍視野，每個視野數(shù)200個腫瘤細胞，計算陽性細胞百分比，取平均值，參照Wachters等[2]的方法來分析免疫組化蛋白的表達水平，即陰性表達：不表達或陽性細胞數(shù)<10%；陽性表達：陽性細胞數(shù)>10%。

1.2.2RT-PCR方法

1.2.2.1總RNA提取

采用總RNA提取試劑盒(美國Invitrogen公司)，從冰凍胃癌組織中提取總RNA。電泳和紫外分光光度法檢測提取核酸的濃度及質(zhì)量。

1.2.2.2RT-PCR檢測Stathmin mRNA水平

使用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶將總RNA后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再用PCR擴增stathmin和內(nèi)參基因β-actin。β-actin上游引物：5-CTTAATGTCACGCACTTC-3，下游引物：5’-GGGCGCCCCAGGCACCA-3，產(chǎn)物長540 bp。

Stathmin上游引物：5-CCCCTTTCCCCTCCAAAGAA-3，下游引物：5-TCGCAAACGTTCCAGTTTGG-3，產(chǎn)物長267 bp。取7μl擴增產(chǎn)物用2%瓊脂糖電泳分離，經(jīng)溴化乙啶染色后，用凝膠成像系統(tǒng)測定Stathmin和β-actin基因的灰度比，作為Stathmin mRNA的相對表達水平。

1.3 統(tǒng)計學方法

全部數(shù)據(jù)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，采用χ2檢驗，F(xiàn)isher精確概率法，比較各組是否有差異。檢驗水準以P≤0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組化結(jié)果

Stathmin蛋白在不同分化程度的胃癌組織中均有不同程度的表達，主要在細胞核及細胞質(zhì)，部分間質(zhì)細胞也有表達，呈棕黃色或棕褐色顆粒(圖1)，但在癌旁組織中的表達則明顯減弱(圖2)。發(fā)現(xiàn)Stathmin蛋白表達與臨床分期、浸潤深度及淋巴轉(zhuǎn)移分化程度均正相關(guān)，而與年齡、性別無關(guān)(表1)。

圖1 Stathmin在低分化腺癌中的表達(×400)

圖2 Stathmin在癌旁組織中陰性表達(×400)

臨床病理資料nStathmin蛋白表達陽性(%)陰性(%)P年齡≥601811(61.1)7(38.9)>0.05<601612(75)4(25)性別男2215(68.2)7(31.8)>0.05女128(66.7)4(33.3)TNM分期I～II125(41.7)7(58.3)<0.05III～IV2218(81.8)4(18.2)分化程度高中分化167(43.75)9(56.25)<0.05低分化1916(88.9)2(11.1)浸潤程度未浸透漿膜61(16.7)5(83.3)<0.05穿出漿膜2822(78.6)6(21.4)淋巴轉(zhuǎn)移 有2520(80)5(20)<0.05 無93(33.33)6(66.67)

2.2 RT-PCR結(jié)果

Stathmin基因在胃癌組織中可測及mRNA表達，高于癌旁組織中的(P<0.05)，將組織每一所測ERCC1和TS基因擴增片段灰度值與相應的內(nèi)參照β-actin基因擴增片段灰度值的比值作為其mRNA表達水平的半定量指標(圖3)

圖3 StathminmRNA電泳結(jié)果

注：1、2為胃癌組織；3為癌旁組織；M為Marker。

2.2.1胃癌組織中Stathmin mRNA表達

34例胃癌組織標本中，27例表達Stathmin mRNA，其表達在患者年齡、性別方面均無統(tǒng)計學差異，而在TNM分期、浸潤程度及有無淋巴轉(zhuǎn)移分化程度方面存在統(tǒng)計學差異(表2)。

表2 StathminmRNA陽性表達的臨床病理資料分析

3 討 論

Stathmin蛋白與細胞的增殖和分化過程密切相關(guān)，通過與微管系統(tǒng)的相互作用，參與細胞的有絲分裂及增殖、分化，影響組織的再生，Stathmin可以在細胞間期及隨后的有絲分裂過程中促使微管解聚，是細胞內(nèi)微管動力學的調(diào)控者。主要通過Stathmin磷酸化水平的改變，來調(diào)節(jié)Stathmin的促使微管解聚的活性。研究表明細胞內(nèi)、外有多種細胞因子、抑癌基因及癌基因的表達產(chǎn)物，經(jīng)過直接或者間接與Stathmin作用引起細胞生物學行為改變[3]。

本研究應用免疫組化SP法和RT-PCR技術(shù)進行Stathmin的檢測，發(fā)現(xiàn)Stathmin在胃癌組織中的mRNA和蛋白的表達水平均高于癌旁組織，提示Stathmin基因與胃癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。這與國內(nèi)外學者的研究結(jié)果相一致，Stathmin的高水平表達可以在多個系統(tǒng)多種腫瘤中檢測到，在乳腺癌，子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌、前列腺癌等生殖系統(tǒng)腫瘤中以及在口腔鱗狀細胞癌和腺樣囊性癌、食管癌，大腸腫瘤，肝癌，胰腺癌消化系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)Stathmin的高表達[4]。Sadowl等[5]研究結(jié)果表明于各種各樣的內(nèi)分泌腫瘤都有Stathmin的存在，尤其在低分化、高增殖腫瘤，包括未分化甲狀腺癌、Merkel細胞癌、皮膚癌和小細胞肺癌。Stathmin在惡性嗜鉻細胞瘤可作為診斷標記。Saldanha等[6]發(fā)現(xiàn)許多惡性上皮癌中失調(diào)的纖維蛋白溶酶原激活起重要作用。

通過分析Stathmin與胃癌臨床病理特征的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，Stathmin蛋白的表達與胃癌臨床分期、浸潤深度及淋巴轉(zhuǎn)移均正相關(guān)，而與年齡、性別無關(guān)，提示Stathmin蛋白與胃癌浸潤、轉(zhuǎn)移等惡性行為有關(guān)，Stathmin與胃癌的預后存在相關(guān)性。Stathmin在多種惡性腫瘤其表達水平與腫瘤惡性度和預后密切相關(guān)，已有研究表明Stathmin表達與食管癌，大腸腫瘤，肝癌的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤深度及TNM分期顯著相關(guān)[7-8]。Stathmin水平的顯著升高與腫瘤的TNM (腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)分級分期密切相關(guān)，III期和IV期中的Stathmin蛋白的表達水平顯著高于I期和II期，可作為預后指標。

Stathmin表達與細胞增殖密切相關(guān)[9]，而Stathmin的高水平表達對于維持腫瘤細胞的高增殖率是必需的，通過利用反義核酸、核酶、單克隆抗體、Stathmin蛋白抑制劑及絲氨酸位點突變體等方法，封閉該基因表達均證實抑制其表達可使細胞受阻于G2/M期，同時可以逆轉(zhuǎn)惡性腫瘤的表型，Stathmin基因及其表達產(chǎn)物是一個極具吸引力的惡性腫瘤生物治療新靶點[10]。已有研究通過抑制Stathmin的表達和功能可抑制惡性腫瘤細胞的生長、擴散，在紅白血病、惡性腦膠質(zhì)瘤、宮頸癌、前列腺癌、胰腺癌、成骨肉瘤細胞等惡性腫瘤腫瘤中已得到證實[11-13]，Alli等[14]發(fā)現(xiàn)微管的聚合狀態(tài)能夠影響其與化療藥物的結(jié)合，Stathmin的高表達能干擾紫杉醇與微管的結(jié)合，降低對紫杉類藥物的敏感性；增加長春堿類藥物與微管的結(jié)合，增加腫瘤細胞對長春堿類藥物的敏感性?？梢岳孟嚓P(guān)基因工程技術(shù)更加高效地抑制Stathmin蛋白在胃癌細胞中的表達從而高效干擾腫瘤細胞的增殖與分化，同時也可協(xié)同增效一些腫瘤化療藥物的抗腫瘤療效，抑制腫瘤細胞Stathmin基因的表達與紫杉醇類藥物有明顯的協(xié)同抗癌效應，將為腫瘤的治療開辟一個新思路。

本研究結(jié)果顯示，Stathmin的表達水平與胃癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，研究還顯示Stathmin與胃癌的浸潤、轉(zhuǎn)移等惡性行為有關(guān)，提示Stathmin高表達者預后差。Stathmin不但可能作為胃癌發(fā)生和發(fā)展的分子標志之一，也同樣可能成為生物治療的一個新靶點。

[1] Yang L.Incidence and mortality of gastric cancer in China[J].World J Gastroenterol,2006,12(1):17-20.

[2] Wachters FM,Wong LS,Timens W,et al. ERCC1, hRad51,and BRCA1 proteinexpression in relation to tumour response and survival of stage III/IV NSCLC patients treated with chemotherapy [J]. Lung Cancer,2007,50 (2): 211-219.

[3] Mikael E Sellin,Per Holmfeldt,Sonja Stenmark,et al. Global Regulation of the Interphase Microtubule Systemby Abundantly Expressed Op18/Stathmin [J].Molecular Biology of the Cell, 2008, 19(7):2897-2906.

[4] 張才云，肖自安.癌蛋白-18與頭頸腫瘤[J].臨床耳鼻咽喉科雜志, 2006，20(3):142-144.

[5] Sadow PM, Rumilla KM, Erickson LA, et al. Stathmin expression in pheochro-mocytomas, paragangliomas, and in other endocrine tumors [J]. Endocr Pathol,2008,19(2):97-103.

[6] Saldanha RG, Xu N, Molloy MP, et al. Differential proteome expression associated with urokinase plasminogen activator receptor (uPAR) suppression in malignant epithelial cancer[J].Proteome Res,2008,7(11):4792-806.

[7] 王瀟,樊青霞,趙培榮,等.微管不穩(wěn)定蛋白Stathmin在食管鱗癌組織中的表達及意義[J].腫瘤基礎(chǔ)與臨床, 2007, 20(5): 372-374.

[8] 張惠中，高萍，閆露,等.Stathmin基因在人成骨肉瘤細胞中的表達及意義[J].癌癥，2004，23(5)：493-496.

[9] 林雪遲,曹亞.Op18/Stathmin信號調(diào)控的研究進展 [J].生命科學研究,2007,11(3):195-199.

[10] Zhang HZ, Wang Y, Gao P,et al. Silencing Stathmin gene expression by survivin promoter-driven siRNA vector to reverse malignant phenotype of tumor cells[J].Cancer Biol Ther, 2006, 5(11).1457-1461.

[11] Mistry SJ, Bank A, Atweh GF, et al. Targeting Stathmin in the prostate cancer therapy[J]. Mol Cancer Ther，2005, 4(12): 1821-1829.

[12] Liang XJ, Choi Y, Sackett DL, et al.Nitrosoureas inhibit the Stathmin-mediated migration and invasion of malignant glioma cells [J].Cancer Res, 2008,68(13):5267-5272.

[13] Jiang L, Chen Y, Chan CY, et al. Down-regulation of Stathmin is required forTGF-beta inducible early gene1 induced growth inhibition of pancreatic cancer cells[J]. Cancer Lett,2009,274(1):101-108.

[14] Alli E, Bash Babula J, Yang JM, et al. Silencing of Stathmin induces tumor suppressor fiinction in breast cancer cell lines harboring mutant p53 [J].Oncogene, 2007, 26(7): 1003-1012.