(泰山醫(yī)學(xué)院附屬聊城二院內(nèi)分泌科，山東 臨清 252601)

2型糖尿病是嚴(yán)重危害人們健康的疾病，特別是對(duì)腎功能的影響不容忽視，由糖尿病引起的終末期腎病(end-stage renal disease, ESRD)在逐漸增加。糖尿病腎病從早期的高灌注、高濾過發(fā)展到ESRD，除血糖控制不良、高血壓、蛋白尿、高蛋白飲食及高血脂等因素外，遺傳因素在病情的逐漸進(jìn)展中起著重要的作用。NR4A1做為核受體超家族中的一員，定位于12q13染色體上，在多種細(xì)胞中表達(dá)，同時(shí)功能十分廣泛，參與了細(xì)胞增殖、分化、凋亡、代謝和進(jìn)化過程。并能夠參與調(diào)節(jié)人體一系列生理及病理反應(yīng)，如能量代謝、應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、動(dòng)脈粥樣硬化、腫瘤等。由于NR4A1上述功能可以影響或加重糖尿病腎病發(fā)生、發(fā)展，因此我們對(duì)兩者之間的相關(guān)性進(jìn)行了研究。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象

1.1.1糖尿病組 按照2007年中國2型糖尿病防治指南診斷及分型標(biāo)準(zhǔn)，隨機(jī)選取我科2010.10～2011.5住院及門診的2型糖尿病患者120例，男性63例，女性57例，平均年齡(55.3±8.4)歲，平均病程(8.2±6.6)年。按照24小時(shí)尿微量白蛋白分為2組：(1)單純2型糖尿病組(單純DM組)：6個(gè)月內(nèi)連續(xù)3次尿白蛋白排泄率≤30 mg/24 h。入選病例60例，男性29例，女性31例。平均年齡(57.6±9.3)歲，平均病程(7.8±5.3)年。(2)糖尿病腎病組(DN組)： 6個(gè)月內(nèi)連續(xù)三次尿白蛋白排泄率>30 mg/24h，且腎功能正常者，并排除尿蛋白生成的藥物及原發(fā)腎臟疾病等其他疾病的影響。入選病例60例，男性32例，女性28例，平均年齡(58.6±10.9)歲，平均病程(10.8±4.6)年。

1.1.2正常對(duì)照組 隨機(jī)選擇在我院體檢的空腹及餐后2小時(shí)血糖正常的健康個(gè)體60例。男31例，女29例。平均年齡(56.5±7.2)歲。

各組間年齡及性別比例相互匹配。所有對(duì)象間均無親緣關(guān)系。所有就診病人簽署知情同意書，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過。

1.2方法

受試者無熱量攝入8小時(shí)后，于第二日清晨6點(diǎn)空腹抽取肘靜脈血3 ml，用ACD 0.5 ml抗凝，保存在-70℃以下，用于抽提基因組DNA。

1.2.1提取全血基因組DNA。瓊脂糖凝膠電泳檢測總DNA的質(zhì)量，紫外分光光度法檢測DNA濃度及純度(圖1)。

圖1 血液基因組DNA凝膠電泳檢測

1.2.2基因多態(tài)性檢測 依據(jù)NR4A1基因多態(tài)性位點(diǎn)rs744690基因序列分別設(shè)計(jì)引物:上游引物：5’-GTTATTACCTGTTCCCTCCTA-3’,下游引物：5’-CTCCTCACAACTTGGCAT-3’。94℃預(yù)變性 3 min，94℃變性 30 s，56℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，重復(fù)完成 36個(gè)循環(huán)，最后在 72℃延伸 10 min。取擴(kuò)增產(chǎn)物4 μl在 1%瓊脂糖凝膠電泳,并在紫外燈下觀察片段大小為669 bp(圖2)。對(duì)同一樣品進(jìn)行重復(fù)三次PCR后檢測，將重復(fù)出現(xiàn)的單一條帶進(jìn)行測序(圖3)。

1.2.3收集樣本的性別、年齡、病程、吸煙史、飲酒史、總膽固醇、甘油三酯、尿微量白蛋白、糖化血紅蛋白等資料，并計(jì)算體重指數(shù)，做眼底血管檢查。

1.2.4統(tǒng)計(jì)分析 用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。Hardy-Weinberg 平衡法檢驗(yàn)各組基因頻率的群體代表性。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。計(jì)數(shù)資料間比較用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料比較用方差分析。Logistic 回歸分析檢測2型糖尿病及2型糖尿病并腎病的危險(xiǎn)因素。

圖2 rs744690PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測

圖3 PCR產(chǎn)物測序分析圖

2 結(jié) 果

2.1組間臨床資料比較(表1) 單純DM組和DN組HbA1c、BMI、甘油三酯、總膽固醇明顯高于正常對(duì)照組(P<0.01)。

表1 各組間臨床資料比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01。

2.2各組間基因型比較(表2) 各組中基因型分布符合Hardy-Weinberg 平衡(P>0.05)。rs744690：DN組、單純DM組、正常對(duì)照組的TT基因型頻率分別為83.3%、65%、61.7%，DN組TT基因型頻率明顯高于單純DM組(χ2=5.26，P<0.05)和對(duì)照組(χ2=7.06，P<0.01) 。單純DM組與正常對(duì)照組相比rs744690TT基因型無明顯差異(P>0.05)。rs2603751：各組間基因型無明顯差異。

表2 rs744690基因型比較

注：與DN組比較,*P<0.05；**與DN組比較,P<0.01。

2.3DN危險(xiǎn)因素分析(表3) Logistic 回歸分析，全部DM組以有無DN為因變量，性別、年齡、病程、吸煙史、飲酒史、體重指數(shù)、總膽固醇、甘油三酯、糖化血紅蛋白、rs744690基因多態(tài)性為自變量。結(jié)果顯示rs744690基因多態(tài)性、糖化血紅蛋白、體重指數(shù)為2型DN發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.01)。

表3 DN危險(xiǎn)因素分析

3 討 論

人體內(nèi)能量代謝是通過激素調(diào)節(jié)主要的靶組織如肝臟、肌肉、脂肪組織，進(jìn)而維持的穩(wěn)定。近來有報(bào)道指出，NR4A1與另外兩個(gè)家族成員NR4A2和NR4A3一起，在能量代謝中發(fā)揮著重要的作用[1]。NR4A1不僅參與細(xì)胞周期調(diào)控(增殖或凋亡)，還與神經(jīng)性疾病[2]、炎癥[3]、腫瘤[4]、糖尿病[5]和心血管疾病[6]發(fā)生關(guān)系密切。多數(shù)疾病發(fā)生的病理生理過程中涉及能量平衡失調(diào)、巨噬細(xì)胞蓄積、血脂異常堆積和血管內(nèi)膜損傷等過程，NR4A1可能參與對(duì)其的調(diào)節(jié)。而這些病理生理過程在糖尿病腎病發(fā)生過程中起到相當(dāng)大的作用。孤核受體NR4A1屬于核激素受體超家族中的一員，其可被多種生理學(xué)信號(hào)及物理刺激誘導(dǎo)表達(dá)。能快速感覺細(xì)胞外環(huán)境的變化，同時(shí)迅速產(chǎn)生反應(yīng)為NR4A1孤核受體亞家族的顯著特性。

本研究探討了NR4A1基因多態(tài)性在糖尿病腎病、單純糖尿病及正常人中的區(qū)別，試圖發(fā)現(xiàn)其在遺傳易感性方面的作用。基因多態(tài)性與疾病相關(guān)性方面有時(shí)會(huì)因?yàn)槿朔N不同而出現(xiàn)不同結(jié)論，例如VEGF基因多態(tài)性與糖尿病腎病相關(guān)性研究在英格蘭高加索人和漢族黃種人中得出不同結(jié)論。Karsten Müssig等[7]以德國南部白人為對(duì)象的研究發(fā)現(xiàn)NR4A1基因多態(tài)性在T2DM和正常對(duì)照組之間無明顯差異，通過實(shí)驗(yàn)我們也得出相同的結(jié)論。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)rs744690基因多態(tài)性為2型DN發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，這可能與NR4A1基因除與炎癥、細(xì)胞凋亡、神經(jīng)營養(yǎng)有關(guān)外，還參與應(yīng)激反應(yīng)及交感神經(jīng)激活有關(guān)，氧化應(yīng)激可通過NADPH氧化酶和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)通路在DN的發(fā)展中起決定性作用?？傮w分析，DN的發(fā)病是一個(gè)多因素共同作用的結(jié)果。單就遺傳方面，DN是一個(gè)多基因遺傳易感性疾病。醛糖還原酶(AR)基因、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(GLUT1) 基因、血管緊張素 轉(zhuǎn)換酶(ACE)基因、一氧化氮合酶(NOS) 基因、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子等均被報(bào)道為DN的易感基因。目前暫無有關(guān)NR4A1與糖尿病及糖尿病腎病關(guān)系的報(bào)道。

綜上所述，本研究雖然發(fā)現(xiàn)NR4A1與糖尿病腎病存在聯(lián)系，但限于樣本量的局限性，不能完全確定兩者聯(lián)系密切程度，并且兩者通過何種機(jī)制建立聯(lián)系有待進(jìn)一步研究。

[1] Zhan Y，Du X，Chen H，et al. Cytosporone B is an agonist for nuclear orphan receptor Nur77 [J]. Nat Chem Biol，2008，4(9)：548-556.

[2] Nomiyama T，Zhao Y，Gizard F，et al. Deficiency of the NR4A neuron-derived orphan receptor-1 attenuates neointima formation after vascular injury[J]. Circulation，2009，119(4):577-586.

[3] Bonta PI，Matlung HL，Vos M，et al. Nuclear receptor Nur77 inhibits vascular outward remodelling and reduces macrophage accumulation and matrix metalloproteinase levels [J]. Cardiovasc Res，2010，87(3)：561-568.

[4] Liu JJ,Zeng HN,Zhang LR,et al.A unique pharmacophore for activation of the nuclear orphan receptor Nur77 in vivo and in vitro[J]. Cancer Res，2010，70(9)：3628-3637.

[5] Pearen MA，Muscat GE. Minireview: Nuclear hormone receptor 4A signaling: implications for metabolic disease[J]. Mol Endocrinol，2010，24(10)：1891-1903.

[6] Akram T，Hasan S，Imran M，et al. Association of polycystic ovary syndrome with cardiovascular risk factors [J]. Gynecol Endocrinol，2010，26(1)：47-53.

[7] Karsten Müssig,Fausto Machicao,Jürgen Machann,et al.No association between variation in the NR4A1 gene locus and metabolic traits in white subjects at increased risk for type 2 diabetes[J].BMC Medical Genetics, 2010, 11:84.