顏波

(1.包頭醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院風濕免疫科；2.包頭醫(yī)學院生物醫(yī)學研究中心；3.包頭醫(yī)學院基礎醫(yī)學院，內蒙古 包頭 014010； 4. 泰山醫(yī)學院附屬醫(yī)院神經(jīng)內科，山東 泰安 27100； 5.包頭師范學院生物系，內蒙古 包頭 014030)

Protein serine/threonine phosphatase-1 (PP1)是腦內表達豐富的一種蛋白磷酸酶，它有4種異構體(a、b、g和d)，PP1a主要存在于胞質，PP1b和PP1d同在胞質和胞核，PP1g主要存在于胞核。每一種異構體都有自己的一套底物[1]。在大腦中，在突觸末端出現(xiàn)PP1的各種異構體的作用是負向調節(jié)神經(jīng)元信號和突觸強度，這些異構體的分子作用是抑制學習記憶。抑制PP1的活性，可以提高海馬依賴的空間學習記憶能力[2-3]。大鼠PP1轉錄起始點上游有一300 bp的GC含量高達79%的區(qū)域，這一高GC區(qū)控制著PP1的轉錄[4]。PP1表達受其promoter區(qū)甲基化的影響，DNA甲基化增加使其表達量降低，并且DNMTs參與了其甲基化的改變[5]。有報道低氧可以誘導PP1的活性改變[6]。本研究利用高保真PCR 克隆了小鼠PP1基因的啟動子區(qū)，為進一步構建特異表達載體及進一步研究其低氧預適應對轉錄表達調控，特別是低氧條件下甲基化對其表達調控的影響奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

昆明小鼠，Expand High Fidelity PCR System(Roche公司)，EZ DNA Methylation-Gold Kit(zymo公司), rTaq(Takara公司),基因組DNA提取試劑盒(康為世紀)，TA clone kit(invitrogen)，DH5α 菌種等。

1.2 引物設計

根據(jù)小鼠PP1基因上游序列設計引物，序列如下：PP1-F:ACTTCTGTCCCCAAGCAGCAGAGCC； PP1-R:GAGTGCAGCGGCCCGGCC。預期擴增產(chǎn)物為320 bp。

1.3 提取基因組DNA，PCR 擴增、T-A 克隆及測序

根據(jù)基因組提取試劑盒說明提取小鼠大腦中基因組DNA，將提取的基因組DNA用RNA酶消化后凍存?zhèn)溆?。?.5 μg基因組DNA作為模板，利用Expand High Fidelity PCR System進行擴增，擴增條件為94℃變性5 min; 94℃、30 s, 52℃、30 s, 72℃、30 s, 30個循環(huán); 72℃延伸8 min。擴增結束后，加入rTaq及dNTP，72℃保溫10 min，使PCR產(chǎn)物加上A。取1 μl PCR 產(chǎn)物，2 μl PCR-2.1載體在T4 DNA連接酶作用下連接16 h。轉化感受態(tài)DH5α細菌，通過藍白斑篩選陽性克隆，提取質粒，經(jīng)酶切鑒定質粒，對含正確插入片斷的質粒測序。

1.4 PP1啟動子區(qū)DNA甲基化情況分析

如1.3方法提取基因組DNA，使用EZ DNA Methylation-Gold Kit將5-mC轉變成T，取1 μl產(chǎn)物為模板，正向引物：CTTCCTCCTCCTCTCGCCACT，反向引物：GTTAGATTTTTGTTTTTAAGTAGTAGAGT，加入rTaq及dNTP進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物如1.3進行TA克隆和測序。

1.5 PP1啟動子區(qū)DNA甲基化位點及轉錄因子結合位點分析

利用ABI公司的Methyl Primer Express software V1.0軟件，對克隆的序列進行CpG位點分析。利用轉錄因子結合位點預測軟件TFSEARCH對PP1啟動子序列的特征性分析。

2 結 果

2.1 小鼠PP1啟動子克隆及鑒定

以人基因組為模板，通過特異性上游引物和下游引物進行PCR擴增，擴增后加上A后與PCR2.1載體經(jīng)T4 DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉化感受態(tài)細菌。藍白斑篩選挑取單克隆，擴大培養(yǎng)，提取質粒，經(jīng)EcoRI酶切，瓊脂糖凝膠電泳檢查片段大小,可獲得到0.3 kb左右和3.9 kb 左右2個目的片段(圖1)。將酶切正確克隆送公司測序，測得序列與Genbank登記的人PP1基因啟動子區(qū)完全相同即為正確的質粒(圖2)。

圖1 PCR2.1-小鼠PP1啟動子區(qū)質粒EcoRI酶切電泳圖

M：Marker；1：PCR2.1-小鼠PP1啟動子區(qū)質粒EcoRI單酶切，切出0.3 kb和3.9 kb兩個片段；2:空PCR2.1 質粒EcoRI酶，切出片段3.9 kb。

2.2 小鼠PP1啟動子區(qū)(-320 bp～0 bp)DNA 甲基化狀態(tài)

通過Bisulfite處理基因組后使5-mC轉換成T，通過測序分析發(fā)現(xiàn)在PP1啟動子區(qū)(-320 bp～0 bp)只有一個CpG二核苷酸被甲基化，結果顯示小鼠PP1啟動子區(qū)(-320 bp～0 bp)處于低甲基化狀態(tài)。

2.3 小鼠PP1啟動子區(qū)(-320 bp～0 bp)DNA甲基化位點分析

Methyl Primer Express software V1.0軟件分析結果顯示(圖3)，在小鼠啟動起始點上游320 bp，G+C含量高達70.25%，CpG含量為11.75%，符合CpG島特征，是潛在的DNA甲基化位點。

圖2 PCR2.1-小鼠PP1啟動子區(qū)質粒Blast結果

圖3 Methyl Primer Express software V1.0分析PP1啟動子區(qū)

2.4 小鼠PP1啟動子轉錄因子結合位點分析

啟動子區(qū)轉錄因子結合位點預測發(fā)現(xiàn)，轉錄起始位點上游的320 bp 區(qū)域內含有大量的順式調控元件，啟動子附近可能結合的轉錄因子主要有: HSF、ADR1、MZF1等。其中以ADR1 的結合頻率最高，含有18 個潛在結合位點。

3 討 論

PP1在突出可塑性中有重要作用，突觸可塑性被認為是學習記憶的主要的細胞基礎。蛋白磷酸酶(PP)是神經(jīng)遞質釋放的關鍵調節(jié)分子；PP1是哺乳動物大腦中通過調節(jié)染色體重塑的關鍵調節(jié)物[7]；PP1為轉錄依賴的學習記憶和突觸可塑性的重要分子[2]，其功能可以抑制記憶。Miller等研究發(fā)現(xiàn)，情景恐懼訓練1小時后，PP1基因的甲基化程度增加，而其mRNA表達出現(xiàn)降低，PP1的甲基化變化影響其表達，而PP1表達變化與記憶相關[5]。

本研究克隆了小鼠PP1基因啟動子區(qū)起始密碼上游320 bp 的片段，該區(qū)域富含G+C，G+C高達70%以上，同時CpG含量達到11%以上，軟件分析其符合CpG島特征。我們將該片段克隆到了PCR2.1載體上，該載體上有多克隆位點，容易將該片段亞克隆到pGL-3 basic中。在PP1起始密碼上游320 bp范圍內，有37個CpG二核苷酸，研究顯示只有一個CpG二核苷酸被甲基化，表明常氧情況下該區(qū)段是處于低甲基化的。在該范圍內有潛在的轉錄因子結合位點70個，其中ADR1的頻率位點最多，達到了18個。SP1結合位點為8個，c-Myb結合位點為6個。我們克隆了該翻譯起始點上游320 bp片段，并且分析了轉錄因子位點，為進一步通過定點刪除來研究DNA甲基化在其轉錄中的作用奠定了基礎。

我們先前研究低氧預適應可以提高小鼠學習記憶能力[8]，由于PP1調節(jié)是學習記憶的重要分子，其表達調控對于明確低氧預適應的腦保護有重要作用。本工作為進一步體外研究低氧預適應提高小鼠學習記憶能力奠定了基礎。

[1] Ulke-Lemee A, Trinkle-Mulcahy L, Chaulk S, et al. The nuclear PP1 interacting protein ZAP3 (ZAP) is a putative nucleoside kinase that complexes with SAM68, CIA, NF110/45, and HNRNP-G[J]. Biochimica et biophysica acta,2007, 1774:1339-1350.

[2] Graff J, Koshibu K, Jouvenceau A, et al. Protein phosphatase 1-dependent transcriptional programs for long-term memory and plasticity[J]. Learning & memory (Cold Spring Harbor, NY),2010, 17:355-363.

[3] Haege S, Galetzka D, Zechner U, et al. Spatial learning and expression patterns of PP1 mRNA in mouse hippocampus[J]. Neuropsychobiology,2010, 61:188-196.

[4] Nomoto K, Shibata N, Kitamura K, et al. Molecular cloning and analysis of the 5'-flanking region of the rat PP1 alpha gene[J]. Biochimica et biophysica acta,1996, 1309:221-225.

[5] Miller CA, Sweatt JD. Covalent modification of DNA regulates memory formation[J]. Neuron,2007, 53:857-869.

[6] Wu Y, Wang H, Brautigan DL, et al. Activation of glycogen synthase in myocardium induced by intermittent hypoxia is much lower in fasted than in fed rats[J]. American journal of physiology,2007, 292:E469-475.

[7] Koshibu K, Graff J, Beullens M, et al. Protein phosphatase 1 regulates the histone code for long-term memory[J]. J Neurosci,2009, 29:13079-13089.

[8] Shao G, Zhang R, Wang ZL, et al. Hypoxic preconditioning improves spatial cognitive ability in mice[J]. Neuro-Signals,2006, 15:314-321.