張小燕，王靜梅，孫延明，剡根強

（石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，石河子832003）

惡性水腫（malignat edema）是由腐敗梭菌為主的多種梭菌引起的家畜的一種急性傳染病。其特征性病變?yōu)閯?chuàng)傷局部發(fā)生急劇炎性水腫，并伴有發(fā)熱和全身毒血癥。該菌為嚴(yán)格厭氧菌，在肝臟表面觸片的標(biāo)本中，該菌呈長絲狀或長鏈狀，在組織內(nèi)則呈長短不一的粗大桿狀菌；培養(yǎng)物涂片染色鏡檢為單個、成雙或短鏈狀，芽胞呈卵圓形，位于菌體中央或近端，略寬于菌體，有周圍鞭毛，能運動，無莢膜［1］。

腐敗梭菌引起的疾病國內(nèi)外均有報道，國外在人的感染方面報道較多［2－4］，主要集中表現(xiàn)在對毒素和疫苗的研究［5］；雖然國內(nèi)也有對腐敗梭菌毒素相關(guān)的研究，但是對于動物腐敗梭菌的研究較少，目前，我國還沒有利用腐敗梭菌的16SrRNA設(shè)計引物進(jìn)行PCR鑒定的相關(guān)報道。

本研究對石河子地區(qū)某牛場死亡12h的病牛肝臟組織進(jìn)行觸片染色鏡檢、病原的分離鑒定、分子生物學(xué)檢測及動物感染，并對分離株某些生物學(xué)特性進(jìn)行檢測，旨在為今后該病的實驗室診斷建立實用的方法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 病料來源與采集

2009－2010年石河子某規(guī)?；膛鲞B續(xù)2年發(fā)生奶牛產(chǎn)前和產(chǎn)后急性死亡，先后死亡11頭3－4歲高產(chǎn)奶牛，患牛均有外傷史，臨床表現(xiàn)體溫升高41．0～41．5℃，厭食，陰門周圍組織高度腫脹，呈暗紅色至褐色，壓之凹陷柔軟。切開病變部位流出紅褐色透明滲出物，并很快成膠胨狀，病牛多于出現(xiàn)癥狀后幾小時至3d死亡，經(jīng)現(xiàn)場診斷，疑為惡性水腫。采取死亡時間在12h內(nèi)發(fā)病牛的肝臟組織。

1．1．2 培養(yǎng)基

葡萄糖胰酶消化培養(yǎng)基、血瓊脂培養(yǎng)基、厭氧糖發(fā)酵培養(yǎng)基、卵磷脂培養(yǎng)基、石蕊牛乳培養(yǎng)基、厭氧吲哚培養(yǎng)基、明膠培養(yǎng)基的配制及操作方法參照文獻(xiàn)［6－7］。

1．1．3 引物

根據(jù)GenBank登錄號為JF733419的腐敗梭菌16SrRNA序列，用Primer premier 5．0軟件設(shè)計1對引物：

上游引物，5′－AACACATGCAAGTCGAGCGA－3′；下游引物，5′－TCGCCACCTACGTATTACCG－3′。引物由北京華大生物工程有限公司合成。

1．1．4 實驗動物

健康昆明系清潔級小鼠12只（15～20g），購自石河子大學(xué)實驗動物中心；健康英國花色毛系普通級豚鼠6只（25～30g）購自新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1．1．5 主要試劑

PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自大連寶生物工程有限 公 司，Taq DNA 聚 合 酶 （5U／μL）、Marker DL2000、dNTP（2．5mmol）均購自廣東東盛生物科技有限公司，PMD19－T連接試劑盒購自Takara公司。

1．2 方法

1．2．1 涂片染色鏡檢

對發(fā)病牛場病死牛肝表面觸片后經(jīng)瑞特氏染色鏡檢。

1．2．2 分離培養(yǎng)

無菌采取肝臟組織，將其接種到新配置的葡萄糖胰酶消化厭氧肉干湯液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)24－48h后，將培養(yǎng)物再次接種到血平板，采用焦性沒食子酸厭氧法，放入溫箱中37℃培養(yǎng)48h，觀察菌落生長情況，菌落形態(tài)以及是否溶血，挑取典型的單個菌落轉(zhuǎn)接于血瓊脂上厭氧培養(yǎng)進(jìn)行純化［8］，保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2．3 分離菌生化鑒定

分離菌的生化鑒定按厭氧菌的方法進(jìn)行，參照參考文獻(xiàn)［6］中的方法。

1．2．4 分離菌的PCR鑒定及克隆測序

挑取分離株典型菌落接種于液體培養(yǎng)基，厭氧培養(yǎng)24h，提取細(xì)菌總DNA。基因組DNA的提取參照文獻(xiàn)［9］中方法，并略加改進(jìn)。PCR反應(yīng)體系（25．0μL）10×Buffer 2．5μL，DNTP 0．5μL，10μmol／L上下游引物各1．0μL，Taq DNA聚合酶0．5μL，模板DNA 2．0μL，剩余加無菌雙蒸水。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4min；94℃ 變性30s；53．1℃退火30s；72℃延伸30s；共30個循環(huán)，72℃延伸7min，PCR產(chǎn)物短時間內(nèi)4℃保存。

取PCR擴增的反應(yīng)產(chǎn)物5．0μL，加到含EB的1．5%的瓊脂糖膠中，在80V電壓下電泳30min，然后在凝膠成像系統(tǒng)下觀察。

將擴增的PCR產(chǎn)物用UNIQ－10柱式DNA膠回收試剖盒回收，回收產(chǎn)物與pMD19－T載體連接，后轉(zhuǎn)化到E．coli DH5α感受態(tài)37℃ 過夜培養(yǎng)，挑取單個菌落，采用菌落PCR方法進(jìn)行陽性鑒定，參照文獻(xiàn)［10］中的方法，并略加改進(jìn)。

挑取陽性菌落在含有Amp的LB肉湯中培養(yǎng)，后送往北京華大生物工程有限公司，對腐敗梭菌的擴增片段進(jìn)行測序。采用DNAMAN軟件分析序列，并與GenBank上登錄的的腐敗梭菌（序列號為JF733419）進(jìn)行同源性比較。

1．2．5 動物實驗

將臨床分離株的純培養(yǎng)，制成菌懸液，分別于腹腔與肌內(nèi)給小鼠與豚鼠注射。小鼠各4只（0．2 mL／只，腹腔注射；0．2mL／只，肌肉注射），對照組各2只；豚鼠各2只（1．5mL／只，肌肉注射；1．5 mL／只，腹腔注射），對照組各1只。對照組的豚鼠及小鼠以相同劑量注射生理鹽水。

2 結(jié)果與分析

2．1 分離株的形態(tài)學(xué)觀察

對發(fā)病牛場病死牛肝表面觸片瑞特氏染色鏡檢，可初步確診為腐敗梭菌引起的病牛的死亡；將分離菌接種至肉干湯中，37℃厭氧培養(yǎng)24－48h，可見培養(yǎng)基內(nèi)產(chǎn)生氣體，培養(yǎng)物呈白色絮狀沉入底部，搖晃后培養(yǎng)基變渾濁。

培養(yǎng)物接種到葡萄糖血瓊脂平板厭氧培養(yǎng)48 h后可見有β溶血現(xiàn)象，在體視顯微鏡下觀察菌落如紐扣狀（圖1）。將典型菌落涂片，革蘭氏染色鏡檢可見革蘭氏陽性大桿菌，芽孢位于菌體中央（圖2），分離株菌落特征，溶血性及菌體特征符合腐敗梭菌特征。

圖1 分離株菌落形態(tài)（10×12．5）Fig．1Colony morphology of isolates（10×12．5）

圖2 分離株菌體形態(tài) （革蘭氏染色10×100）Fig．2Bacteria morphology of isolates（Gram10×100）

2．2 生化鑒定結(jié)果

生化鑒定以產(chǎn)氣莢膜梭菌作對照。由表1可見，分離株明膠液化；能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、乳糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣；不發(fā)酵蔗糖；能消化石蕊牛奶，但不能凝固牛乳；不產(chǎn)生硫化氫；吲哚試驗陰性；卵磷脂和酯酶實驗均是陰性。結(jié)果符合腐敗梭菌生化特性。

表1 分離株生化實驗結(jié)果Tab．1The results of biochemistry experiment

2．3 PCR擴增結(jié)果鑒定

分離株泳道在472bp處有明顯的條帶（圖3），與預(yù)期的擴增片段大小相一致。

2．4 克隆測序及同源性分析

將分離株擴增的PCR產(chǎn)物的片段回收后進(jìn)行克隆測序。測序結(jié)果用DNAMAN進(jìn)行分析比對，結(jié)果與GenBank中登錄的序列號為JF733419的腐敗梭菌的同源性達(dá)95．43%（圖4），其中有16個堿基突變，2個堿基缺失。

圖3 腐敗梭菌的PCR鑒定Fig．3PCR identification of Clostridium septicum

圖4 分離株與JF733419序列比對結(jié)果Fig．4The comparison of gene sequence between JF733419and isolates

2．5 動物實驗結(jié)果

小鼠感染分離株5－7h后，表現(xiàn)精神沉郁，8只感染小鼠均在12h內(nèi)死亡；豚鼠感染分離株后，在30h相繼表現(xiàn)閉眼，厭食，精神沉郁，閉目最后死亡，4只感染豚鼠均在48h先后死亡。注射生理鹽水的對照組小鼠和豚鼠均存活。

無菌采取感染分離株死亡后小鼠及豚鼠肝臟觸片，瑞特氏染色鏡檢可見呈長絲狀無關(guān)節(jié)菌體（圖5），其菌體形態(tài)與死亡奶牛肝臟觸片形態(tài)一致，也與腐敗梭菌的特性相一致。

圖5 肝觸片 （革蘭氏染色，10×100）Fig．5Liver tissue smear（Gram，10×100）

2．6 感染動物分離株的PCR檢測結(jié)果

將感染分離株的小鼠及豚鼠死亡后的肝臟按1．2．4中的方法進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果擴增出了472 bp的片段（圖6）與奶牛自然感染分離株的PCR擴增片段一致。

圖6 腐敗梭菌實驗動的PCR鑒定圖片F(xiàn)ig．6PCR identification of animals infected with Clostridium septicum

3 討論

腐敗梭菌廣泛存在于牛舍糞便中，屬于專性厭氧菌，其芽胞的抵抗力極強，可隨塵埃在牛舍內(nèi)散布，但奶牛感染多發(fā)生于外傷如采血、免疫注射、分娩助產(chǎn)有關(guān)，一般呈散發(fā)。該牛場在2009和2010年同一時間先后發(fā)生11頭相同癥狀的惡性水腫病例，經(jīng)調(diào)查發(fā)病牛均有產(chǎn)前注射口蹄疫疫苗或分娩時助產(chǎn)史［11］。這可能由于消毒不嚴(yán)而經(jīng)傷口感染發(fā)病。因此，防止牛體外傷及傷口及時處理，做好注射、助產(chǎn)的無菌操作與術(shù)后護(hù)理，定期對牛舍特別是發(fā)病牛的污染物及所處環(huán)境進(jìn)行消毒，這是預(yù)防該病的前提。

由實驗動物感染結(jié)果表明，分離株無論經(jīng)肌內(nèi)或腹腔注射，致死率均為100%，說明其具有較強的致病性。通過對病死牛剖檢及肝臟觸片染色，初步診斷得出病原菌為腐敗梭菌，再經(jīng)病原菌的分離、生化鑒定、實驗動物感染、分離株P(guān)CR鑒定及克隆測序和同源性分析，結(jié)果表明該奶牛場奶牛急性死亡病例系由腐敗梭菌引起的奶牛惡性水腫所致。

本研究的病料來源于生產(chǎn)，通過結(jié)合臨床及實驗室的診斷方法，為腐敗梭菌引起奶牛惡性水腫病的診斷及病原菌的分離鑒定提供依據(jù)。

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