張德力，徐貝貝，李春輝

(1.承德醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000;2.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

胃癌是我國(guó)常見惡性腫瘤之一，在我國(guó)的發(fā)病率居各類腫瘤的首位，但其發(fā)病機(jī)制目前尚未明確[1]。微管相關(guān)蛋白(MAP）是與微管結(jié)合的非微管結(jié)構(gòu)蛋白，目前已發(fā)現(xiàn)和提純的MAP主要有MAP-1、MAP-2、MAP-4和Tau等，它們參與微管的組裝、維持微管的穩(wěn)定和微管與其它骨架纖維間的連接[2]。Tau蛋白為微管聚合蛋白，是細(xì)胞骨架的重要成分，其與微管結(jié)合能誘導(dǎo)微管成束，增強(qiáng)微管的穩(wěn)定性。當(dāng)細(xì)胞骨架發(fā)生異常變化時(shí)，可使細(xì)胞黏附能力下降、運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)，引起細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。Tau還是有絲分裂期紡錘體的主要成分，可使腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期順利進(jìn)行，為腫瘤細(xì)胞的無(wú)限增殖提供條件，加速惡性腫瘤的進(jìn)展[3]。本研究對(duì)Tau mRNA在胃癌中的表達(dá)及與胃癌臨床病理特征的關(guān)系進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2008年12月至2010年3月手術(shù)切除經(jīng)病理證實(shí)為胃癌的組織標(biāo)本60例及正常胃組織(距離腫瘤10cm以上）10例，取材后迅速投入液氮中保存。60例胃癌患者，男49例、女11例，年齡43-77歲，平均(58.3±10.0）歲;高中分化者28例、低分化者32例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者25例、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者35例，Ⅰ+Ⅱ期32例，Ⅲ+Ⅳ期28例。10例正常胃組織，男6例、女4例，年齡45-70 歲，平均(59.5±5.0）歲。

1.2 試劑與儀器 Trizol，美國(guó)Invitrogen公司;異丙醇、乙醇、瓊脂糖，北京化學(xué)試劑公司;AMV反轉(zhuǎn)錄試劑盒，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;PCR擴(kuò)增試劑盒、50bp DNA Ladder，北京天根生化有限公司;溴化乙錠(EB)，美國(guó)Promega公司。超速離心機(jī)，美國(guó)Sigma公司;Bio-mini紫外分光光度計(jì)，日本島津公司;PCR擴(kuò)增儀，美國(guó)Research公司。

1.3 RT-PCR檢測(cè)Tau mRNA的表達(dá) 取100mg液氮中保存胃癌組織或正常胃組織，按Trizol總RNA抽提說明書操作，提取胃癌組織或胃組織的總RNA。取1μl RNA，含EB的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提取的RNA是否完整后，紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定230nm、260nm、280nm波長(zhǎng)處的OD值，計(jì)算OD260/OD280，確定RNA的純度及濃度。取1000ng總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)條件為25℃，10min;37℃，50min;70℃，15min;4℃，5 min。

RCR反應(yīng)引物序列:Tau上游引物(5’→3’)為GTG ACC CAA GAG CCT GAA AGT，下游引物(5’→3’)為GGT GCA GGT CTC CTA GAA GC;PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5min，95℃變性45s、69℃退火45s、72℃延伸30s、循環(huán)40次，72℃最終延伸10min結(jié)束反應(yīng)。β-actin上游引物(5’→3’)為CAT GTA CGT TGC TAT CCA GGC，下游引物(5’→3’)為CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT;反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5min，95℃變性45s、58℃退火45s、72℃延伸30s、循環(huán)31次，72℃最終延伸10min結(jié)束反應(yīng)。取10μl PCR產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外熒光數(shù)字成像儀攝像并進(jìn)行光密度定量分析，以Tau與β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物條帶累積光密度(IOD)的比值作為Tau mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料用(±s）表示，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正常胃組織與胃癌組織Tau mRNA的表達(dá) 胃癌組織Tau mRNA的表達(dá)為(0.78±0.08），明顯高于正常胃組織(0.53±0.01），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。

2.2 胃癌組織Tau mRNA的表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系 見附表。不同年齡、性別和腫瘤長(zhǎng)度胃癌Tau mNA的表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05）。胃癌組織Tau mRNA的表達(dá)與胃癌分化程度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)(P＜0.05）:低分化胃癌Tau mRNA的表達(dá)明顯高于高中分化胃癌，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者Tau mRNA的表達(dá)明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者;TNM Ⅲ+Ⅳ期者Tau mRNA的表達(dá)明顯高于Ⅰ+Ⅱ期者。

附表 Tau mRNA在胃癌中的表達(dá)及與胃癌臨床病理特征的關(guān)系(n=60）

3 討論

MAPs分子至少包含一個(gè)結(jié)合微管的結(jié)構(gòu)域和一個(gè)向外突出的結(jié)構(gòu)域。MAPs包括Ⅰ型和Ⅱ型兩大類:Ⅰ型對(duì)熱敏感，如MAP1a、MAP1b，主要存在于神經(jīng)細(xì)胞中;Ⅱ型熱穩(wěn)定性高，包括MAP2a、b、c，MAP4和Tau蛋白[4]。MAP的主要功能是促進(jìn)微管聚集成束、增加微管的穩(wěn)定性和強(qiáng)度以及促進(jìn)微管組裝。不同微管間的差異，主要與結(jié)合于微管上的非微管結(jié)構(gòu)蛋白有關(guān)[5]。已有人發(fā)現(xiàn)將Tau基因轉(zhuǎn)染入正常并不表達(dá)Tau蛋白的細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，Tau蛋白與微管結(jié)合或誘導(dǎo)微管成束，從而增加微管的穩(wěn)定性[6]。研究表明，腫瘤組織Tau表達(dá)增加可導(dǎo)致腫瘤的加速生長(zhǎng)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。以往關(guān)于Tau蛋白的研究多集中在神經(jīng)系統(tǒng)[6-8]，在胃癌中的研究較少。Tau蛋白作為有絲分裂期紡錘體的主要成分，可使細(xì)胞周期順利進(jìn)行，為癌細(xì)胞無(wú)限增殖提供條件[9-10]。

本研究結(jié)果顯示胃癌組織Tau mRNA的表達(dá)明顯高于正常胃組織、低分化胃癌明顯高于高中分化胃癌、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者、TNM Ⅲ+Ⅳ期胃癌明顯高于Ⅰ+Ⅱ期胃癌，提示胃癌組織Tau mRNA的表達(dá)水平出現(xiàn)異常，與腫瘤的分化程度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤侵襲密切相關(guān)。

本研究對(duì)正常胃組織及胃癌組織Tau mRNA的表達(dá)進(jìn)行了研究，對(duì)了解胃癌的發(fā)生機(jī)制及判斷預(yù)后均具有重要的參考意義。同時(shí)，隨著微管性質(zhì)和功能不斷被闡明，微管作為抗腫瘤藥物研究的一個(gè)熱門靶點(diǎn)，必定會(huì)發(fā)現(xiàn)更多的有顯著抗腫瘤作用的微管抑制劑。

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