孫全昌，劉榮霞，鄭紀(jì)寧

(承德醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000)

大腸癌是人類主要惡性腫瘤之一，近年來在我國，特別是大城市其發(fā)病率有上升趨勢。有研究顯示，葉酸攝入過低或合成減少是大腸癌的危險因素之一[1]。而亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)，是葉酸代謝的限速酶，能不可逆的催化5,10-亞甲基四氫葉酸向5-甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)化，后者作為甲基供體經(jīng)蛋氨酸合成酶的催化，使同型半胱氨酸轉(zhuǎn)化為蛋氨酸，蛋氨酸作為甲基供體參與DNA甲基化。因此，MTHFR基因多態(tài)可能通過影響DNA的甲基化水平或影響DNA合成，改變不同基因型個體癌癥的易感性。目前關(guān)于A1298C位點多態(tài)與大腸癌易感性的研究較少，且研究結(jié)果存在較大差異[2]。本文選擇河北省承德市作為研究地點，探討MTHFR基因A1298C多態(tài)與大腸癌易感性的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對象 2010年7月至2011年6月就診于承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科的大腸癌(CRC）患者120例，所有病例均經(jīng)臨床資料和組織病理學(xué)檢查確診。其中，男64例、女56例，年齡28-80歲，平均62歲。

1.2 主要試劑 TIANamp Genomic DNA提取試劑盒，天根生物技術(shù)有限公司;2xTaq MasterMix、DNA Marker、引物(上游引物5’-CTTTGGGGAGCTGAAGG ACTACTAC-3’，下游引物5’-CACTTTGTGACCATT CCGGTTTG-3’），上海生工生物工程有限公司;內(nèi)切酶MboⅡ，F(xiàn)ermentas公司。

1.3 方法

1.3.1 提取DNA:采集研究對象外周靜脈血2ml，采集管EDTA抗凝，按試劑盒說明提取外周血總基因組DNA，-20℃保存。

1.3.2 PCR擴增:MTHFR基因A1298C多態(tài)位點檢測采用PCR-RFLP方法。反應(yīng)體系20μl，含上、下游引物(10μmol/L）各1.0μl，2xTaq MasterMix(內(nèi)含Taq DNA、PCR Buffer、MgCl2和dNTP）10μl，DNA 溶液2μl，ddH2O 0.6μl。反應(yīng)條件94℃預(yù)變性2min，94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，共34 個循環(huán)，72℃延伸2min。

1.3.3 MboⅡ酶切:酶切總體系31.5μl，其中PCR擴增產(chǎn)物10μl，Buffer 2μl，Mbo Ⅱ 1.5μl，雙蒸水18μl。輕輕混勻并短暫離心，37℃消化3h，65℃ 20min滅活MboⅡ。1.3.4 多態(tài)性分析:取酶切產(chǎn)物10μl，3%瓊脂糖凝膠電泳確定基因型，包括野生型純合子A/A(56bp)、雜合子A/C(56/84bp)和變異型純合子C/C(84bp)三種。

1.4 統(tǒng)計分析 ⑴Hard-Weinberg Equilibrium(H-W平衡)分析:應(yīng)用H-W平衡軟件計算大腸癌患者基因型的分布，P＞0.05說明研究人群符合H-W平衡。⑵采用χ2檢驗分析大腸癌患者基因型和等位基因頻率的分布;采用非條件Logistic回歸法計算表示相對危險度的比值比(OR）及95%可信區(qū)間(CI），OR值經(jīng)性別、年齡、吸煙、飲酒等因素校正。

2 結(jié)果

2.1 MTHFR A1298C與大腸癌的風(fēng)險 與AA純合子相比，CC純合子的大腸癌風(fēng)險降低至0.63倍(95%CI:0.19-2.09，P＞0.05），AC雜合子的大腸癌風(fēng)險升至1.03倍(95%CI:0.61-1.73，P＞0.05）。大腸癌患者A1298C C等位基因頻率為19.6%，A1298C C等位基因大腸癌的風(fēng)險是A1298C A等位基因的0.91倍(95%CI:0.60-1.39，P＞0.05）。見表1。

表1 MTHFR A1298C基因型頻率及與大腸癌(CRC）的易感性[n(%）]

2.2 MTHFR A1298C與大腸癌病理特征的關(guān)系

MTHFR基因A1298C多態(tài)與腫瘤大小、位置、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Duke’s分期均無關(guān)(P＞0.05)。見表2。

表2 MTHFR A1298C基因型頻率與CRC病理特征的關(guān)系[n(%)]

3 討論

葉酸是B族維生素，在人體中作為一碳單位轉(zhuǎn)化酶系的輔酶參與核酸代謝和DNA的甲基化。MTHFR是葉酸代謝的關(guān)鍵酶，MTHFR活性下降可導(dǎo)致機體內(nèi)葉酸缺乏，最終影響DNA的甲基化水平，DNA低甲基化可導(dǎo)致相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的增高[3]。研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)、直腸良性腺瘤和結(jié)、直腸癌中，總體DNA的甲基化水平分別較正常黏膜低8%和10%，特定原癌基因如c-Ha-ras及c-ki-ras基因也呈低甲基化狀態(tài)，提示大腸癌的發(fā)生可能與DNA的低甲基化有關(guān)[4]。MTHFR基因位于1號染色體1p36.1，迄今為止發(fā)現(xiàn)了20多個突變位點，但多態(tài)性位點較少，對于A1298C的研究較少，1298位點存在A→C突變，使編碼的氨基酸由谷氨酸(Glu）變?yōu)楸彼?Ala）。朱慧萍等[5]發(fā)現(xiàn)，A1298C多態(tài)性與MTHFR活性有關(guān)，認(rèn)為A→C的突變會降低MTHFR的活性，但與熱穩(wěn)定性無關(guān)。MTHFR A1298C突變基因在人群中的分布存在差異，在中國北方漢族為20%[6]。本研究發(fā)現(xiàn)MTHFR A1298C突變基因的頻率為19.6%，與以往的報道基本一致。

本研究結(jié)果顯示，MTHFR基因A1298C多態(tài)與大腸癌的易感性無顯著相關(guān)，這與國內(nèi)朱凡等[7]的研究結(jié)果一致。但不同種族的人群基因的突變頻率可能不同，而且由于地理條件和環(huán)境因素等原因，相同的基因突變在不同人群中所起的作用也可能不同。俞曉靜等[8]對MTHFR基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌易感性的Meta分析表明，1298位點與結(jié)、直腸癌的易感性存在相關(guān)，CC基因型可能是結(jié)、直腸癌的低危因素。這種研究結(jié)果的不一致性可能與疾病遺傳異質(zhì)性、葉酸攝入量及樣本數(shù)量的差異等有關(guān)。

MTHFR基因A1298C多態(tài)與大腸癌腫瘤大小、位置、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Duke’s分期均無關(guān)。進一步探討MTHFR在大腸癌病因?qū)W中的作用，需要加大樣本量并研究MTHFR基因多態(tài)與蛋氨酸、同型半胱氨酸及葉酸攝入量之間的交互作用。

[1]La Vecchia C, Negri E, Pelucchi C, et al.Dietary folate and colorectal cancer[J].Int J Cancer, 2002, 102(5):545-547.

[2]Kono S,Chen K.Genetic polymorphisms of methylenetetrahydrofolate reductase and colorectal cancer and adenoma[J].Cancer Sci, 2005, 96(9):535-542.

[3]姜愛仁,吳建中,高長明,等.亞甲基四氫葉酸還原酶A1298C基因多態(tài)性和生活習(xí)慣相互作用與胃癌的易感性[J].河北醫(yī)藥,2004,26(11):851-853.

[4]張?zhí)鞚?徐光煒.腫瘤學(xué)(中冊)[M].天津:科學(xué)技術(shù)出版社,1996.1627-1629.

[5]朱慧萍,劉明珠,刀京晶,等.MTHFR基因第1298位核苷酸多態(tài)性與酶活性的關(guān)系[J].北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2000,32(3):262-264.

[6]Xiao Y, Shan K, Li Y, et al.5,10- methylenetetrahydrofolate reductase polymorphism in three nationalities of Guizhou in China[J].Chin J Med Genet, 2005, 22(2):219-221.

[7]朱凡,王敏明,張勤英.血漿同型半胱氨酸、血清葉酸及亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性與結(jié)、直腸癌發(fā)病關(guān)系的研究[J].東南大學(xué)學(xué)報,2010,29(1):88-92.

[8]俞曉靜,陳坤,金明娟,等.5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌易感性關(guān)系的Meta分析[J].中國慢性病預(yù)防與控制,2006,14(2):115-118.