苗麗霞，李 明，王亞峰，孫巖峰，王 軍，袁海蓮，李彥珊，劉紅艷，劉秋玲

CIK細胞聯(lián)合化療治療兒童中晚期視網(wǎng)膜母細胞瘤的安全性及初步療效觀察

苗麗霞1，李 明2，王亞峰1，孫巖峰1，王 軍1，袁海蓮1，李彥珊1，劉紅艷1，劉秋玲1

目的觀察細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞(cytokine－induced killer cells，CIK細胞)聯(lián)合化療治療中晚期視網(wǎng)膜母細胞瘤的安全性和近期療效。方法選取30例D期后視網(wǎng)膜母細胞瘤患兒為研究對象，15例行化療(對照組)，15例行CIK細胞輸注聯(lián)合化療(聯(lián)合組)。在化療前取聯(lián)合組患兒自體外周血10～35 ml，體外擴增培養(yǎng)約10 d，隔天1次，分3次回輸。觀察患兒細胞回輸過程中的生命體征，監(jiān)測細胞回輸前及回輸后4周左右外周血血常規(guī)、生化指標、細胞免疫指標變化及生活質(zhì)量改善情況、不良反應(yīng)。結(jié)果(1)安全性良好，聯(lián)合組患兒共接受46個周期的CIK細胞治療，所有患兒在CIK細胞回輸過程中及回輸后生命體征穩(wěn)定。在46個療程138次的CIK細胞回輸過程中，僅有3例次出現(xiàn)發(fā)熱，24 h后均恢復(fù)正常;所有患者未出現(xiàn)過敏反應(yīng);肝腎功能、心肌酶結(jié)果在細胞回輸后未出現(xiàn)顯著性變化。(2)在隨訪期間聯(lián)合組患兒有效率及疾病控制率(73.3%，93.3%)均較對照組(67.7%，80%)提高，但差異無統(tǒng)計意義。聯(lián)合組患兒均出現(xiàn)體力增加，食欲改善(P＜0.05)，聯(lián)合組細胞免疫指標改善，CD4+CD25+比例變化有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論在視網(wǎng)膜母細胞瘤患者中進行自體CIK細胞治療明顯改善了患者的近期臨床癥狀，是一種安全的方法。

CIK細胞;中晚期視網(wǎng)膜母細胞瘤;治療

視網(wǎng)膜母細胞瘤(retinoblastoma，RB)是嬰幼兒最常見的眼內(nèi)原發(fā)性惡性腫瘤，近年來發(fā)病率逐年增高，嚴重威脅患兒的視力和生命。對RB的治療目前已形成化學(xué)減容聯(lián)合局部治療為主的模式，但在我國由于RB診斷時多已進入中晚期，因腫瘤巨大，無法進行局部治療，僅靠化療難以完全清除病灶，部分患兒仍避免不了眼球摘除甚至眶內(nèi)容物剜除的手術(shù)。細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞(cytokineinduced killer cell，CIK)因其體外增殖速度快、抗腫瘤活性強、抗腫瘤譜廣、可以調(diào)節(jié)并增強機體的免疫功能等優(yōu)勢已逐漸成為抗腫瘤治療研究的熱點［1－4］，并被廣泛應(yīng)用于成人多種惡性腫瘤及少數(shù)兒童血液系統(tǒng)腫瘤的治療。以CIK細胞為基礎(chǔ)的過繼細胞免疫治療以其明確的治療優(yōu)勢已成為繼手術(shù)、放療和化療之后的第四大腫瘤治療模式;但在小兒惡性實體腫瘤中尚未見臨床應(yīng)用的報道。筆者對2010－04至2012－04住院的15例中晚期RB患兒在常規(guī)化療的基礎(chǔ)上進行自體CIK細胞治療，并設(shè)立單純化療組15例進行對照研究。

1 對象與方法

1.1 對象 在我科住院經(jīng)臨床診斷(部分為病理確診)的30例中，晚期RB患者(即按IIRC分期均為D期后)分為2組:對照組15例(單純化療組)和聯(lián)合組15例(即化療聯(lián)合CIK細胞治療組)。聯(lián)合組中男9例，女6例，年齡4～53個月，中位年齡18個月，單眼9例，雙眼6例，共21只眼。對照組中男9例，女6例，年齡2～54個月，單眼9例，雙眼6例，共21只眼。兩組患兒的年齡、性別及腫瘤分期差異無統(tǒng)計學(xué)意義。治療前1個月所有入組患兒未做任何抗腫瘤治療且未使用免疫增強藥，血常規(guī)淋巴細胞＞1.5×109/L，心電圖正常，肝腎功能無明顯異常，肝炎、性病抗體均為陰性，預(yù)計生存期＞6個月。本臨床試驗的程序經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審查批準，治療前均取得患兒家長的同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 RB患者外周血T亞群檢測 聯(lián)合組RB患者治療前及治療2療程后4周采集外周血2 ml，以肝素抗凝，24 h內(nèi)送檢，采用流式細胞術(shù)檢測外周血T淋巴細胞亞群。所用儀器為美國BD公司FACSCalibur型流式細胞儀，單克隆抗體為美國BD公司的BD Tritest產(chǎn)品。

1.2.2 RB患者化療方案 長春新堿1.5 mg/m2，d1;依托泊苷 150 mg/m2，d1、d3;卡鉑 560 mg/m2，d1。對照組按上述方案行單純化療。聯(lián)合組化療前1 d抽取外周靜脈血培養(yǎng)CIK細胞，化療后(即采血后11 d)行CIK細胞回輸。每4周為一個療程，2個療程后評價初步療效。

1.2.3 CIK細胞的制備及回輸 聯(lián)合組行化療前根據(jù)患兒體重的不同抽取自身外周靜脈血15～35 ml，用淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞，在體外用多種細胞因子(CD3McAb、IL－2、IFN － γ、IL－1α等)的培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)擴增，經(jīng)過10 d誘導(dǎo)擴增后獲得CIK細胞。經(jīng)微生物及細胞活性檢測合格后，經(jīng)靜脈分3次回輸給患兒，每隔1 d回輸1次。

1.2.4 療效及安全性評價 近期療效按照實體瘤治療療效評價標準RECIST［5］進行評價，分為完全緩解(complete remission，CR):可測量的病灶完全消失，維持 4周以上;部分緩解(partial remission，PR):可測量的病灶最大直徑及最大垂直徑的乘積縮小≥50%，無新病灶出現(xiàn);穩(wěn)定(stable disease，SD):可測量的病灶兩徑線乘積縮小＜25%或增大＜25%，無新病灶出現(xiàn);進展(progressive disease，PD):可測量病灶的兩徑線乘積增大＞25%，或出現(xiàn)新的病灶。有效率(response rate，RR)=［(CR+PR)/治療患者總數(shù)］×100%;以CR+PR+SD計算疾病控制率(disease control rate，DCR)。隨訪過程中每個療程前后進行血常規(guī)、生化及淋巴細胞亞群、神經(jīng)元烯醇化酶檢查。每個療程前均拍眼底照片，治療前及2個療程后行核磁、眼部超聲、外周血T、B淋巴細胞亞群檢測。按照WHO化療毒副反應(yīng)作用分級標準，觀察回輸過程中及回輸后的不良反應(yīng)，直至不良反應(yīng)消失或接受其他治療。

2 結(jié) 果

2.1 CIK細胞聯(lián)合化療的安全性評價 在15例RB患兒的46例次CIK細胞回輸過程中及回輸后，3例次出現(xiàn)發(fā)熱，發(fā)熱時間均在輸注細胞后8 h內(nèi)。其中1例次為高熱，最高39℃，無任何伴隨癥狀，口服退熱藥后熱退至正常，且未再出現(xiàn)發(fā)熱。2例次為低熱，低于38℃，未予退熱藥處理，經(jīng)過多次飲水，24 h內(nèi)體溫均恢復(fù)正常。未出現(xiàn)皮疹及變態(tài)反應(yīng)。所有患兒的肝、腎功能及心肌酶、心電圖在CIK細胞治療后與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05，表 1)。

2.2 CIK細胞聯(lián)合化療的近期療效

2.2.1 生活質(zhì)量 對照組中，化療后所有患兒均出現(xiàn)精神反應(yīng)差、活動耐量下降，食欲缺乏。在聯(lián)合組中，和使用CIK前及對照組相比，CIK應(yīng)用2療程后聯(lián)合組全部患兒均精神好轉(zhuǎn)，活動耐量增加，食欲明顯增加，化療耐受性提高。差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，表2)。

表1 兒童視網(wǎng)膜母細胞瘤兩組治療后生化指標異常人數(shù)比較 (n)

表2 兒童視網(wǎng)膜母細胞瘤兩組近期癥狀改善情況比較(n)

2.2.2 有效率及疾病控制率 兩組RB患兒中位隨訪13個月(5～24個月)，近期療效見表3。至隨訪結(jié)束，對照組患兒有效率66.7%(10/15)，疾病控制率為80%(12/15);聯(lián)合組患兒有效率為73.3%(11/15)，疾病控制率為93.3%(14/15)。聯(lián)合組較對照組有效率和疾病控制率有所提高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表3 兒童視網(wǎng)膜母細胞瘤兩組近期療效比較 (n)

2.2.3 CIK細胞聯(lián)合化療對患兒外周血T淋巴細胞亞群的影響 聯(lián)合組15例患兒共接受了46個療程的CIK細胞治療，最多5個療程，最少的2個療程。其中5個療程1例，4個療程3例，3個療程7例，2個療程4例。對照組和聯(lián)合組完成化療療程總數(shù)相等，最少6個療程，最多8個療程。兩組患兒治療前后外周血T淋巴細胞亞群的變化如表4所示，聯(lián)合組和對照組治療前各免疫標記比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義。對照組治療后外周血中CD3+CD56+百分比均下降，CD8+、CD4+CD25+百分比上升，治療前后變化均無統(tǒng)計學(xué)差異;CD4+比例治療后明顯下降，治療前后變化有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。聯(lián)合組CD4+、CD3+CD56+比例在治療后有所增加，CD8+治療后略有下降，但無統(tǒng)計學(xué)差異;CD4+CD25+比例下降明顯，有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。聯(lián)合組和對照組比較，治療前CD4+、CD3+CD56+、CD8+、CD4+CD25+百分比無統(tǒng)計學(xué)差異;治療后聯(lián)合組CD4+、CD3+CD56+比例有所增高，CD8+比例略有下降，但無統(tǒng)計學(xué)差異;CD4+CD25+比例下降明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。

表4兒童視網(wǎng)膜母細胞瘤兩組外周血T淋巴細胞亞群在治療前和2個療程后的變化(±s;%)

表4兒童視網(wǎng)膜母細胞瘤兩組外周血T淋巴細胞亞群在治療前和2個療程后的變化(±s;%)

注:與本組治療前比較，①P＜0.05;聯(lián)合組和對照組治療后比較，②P＜0.05

組別 例數(shù) CD4+ CD8+ CD3+CD56+ CD4+CD25+對照組治療前 15 36.4 ±9.5 26.3 ±5.3 2.7 ±2.3 2.2 ±1.0治療后 15 32.6±10.8① 29.4±4.7 2.1 ±1.9 2.4±1.1聯(lián)合組治療前 15 34.3 ±11.0 29.4 ±8.1 2.8 ±2.7 2.2 ±1.0治療后 15 36.8 ±8.4 27.2 ±7.9 3.1 ±2.8 0.9 ±0.8①②

3 討 論

近年來，隨著多學(xué)科綜合治療水平的提高，手術(shù)及輔助放、化療大大降低惡性實體腫瘤患兒的腫瘤負荷，使生存率有了明顯的提高［6］。但在放、化療過程中，由于其嚴重不良反應(yīng)的存在和晚期腫瘤患兒機體免疫功能低下等因素，導(dǎo)致治療方案的實施和獲益受到了限制［7］。因此，探索新的輔助治療方法受到了廣泛的關(guān)注和研究。

CIK細胞治療是近年發(fā)展起來的腫瘤過繼免疫治療。CIK細胞是將患者外周血單個核細胞分離后，在體外經(jīng)多種細胞因子刺激后獲得的一群異質(zhì)性細胞，以 CD3+CD56+共同表達為特點［8］。目前關(guān)于CIK細胞對腫瘤細胞的殺傷機制尚未完全闡明，可能通過黏附因子識別并直接殺傷腫瘤細胞;通過分泌多種抗腫瘤細胞因子發(fā)揮免疫介導(dǎo)的間接殺傷作用;亦可誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡及壞死［9－11］。CIK細胞治療以增殖速度快、殺瘤譜廣、殺瘤活性高、非MHC限制、對骨髓造血功能影響輕微等優(yōu)勢，在清除微小腫瘤病灶，提高患者免疫功能，增強放化療耐受性等方面取得了良好的療效，且不良反應(yīng)輕微。目前CIK細胞治療聯(lián)合放化療已應(yīng)用于成人多種惡性腫瘤及少數(shù)兒童血液系統(tǒng)腫瘤的治療［12－15］。但在兒童實體瘤中，除兒童淋巴瘤外，未曾有CIK細胞治療的報道。

本研究將CIK細胞與化療聯(lián)合應(yīng)用于中晚期RB患兒的治療，安全性良好，且取得了初步療效。CIK細胞回輸中常見的不良反應(yīng)有寒戰(zhàn)、發(fā)熱、肌痛等感冒樣癥狀或胃腸道反應(yīng)，體溫一般不超過38℃，多數(shù)可自行消退。本研究中有3例次出現(xiàn)發(fā)熱，未出現(xiàn)感冒樣癥狀及胃腸道反應(yīng)，3例次發(fā)熱均在24 h內(nèi)緩解，所有患兒肝腎功能、心肌酶及心電圖治療前后無明顯變化，初步說明CIK細胞治療在兒童RB治療中安全性良好。CIK細胞治療可以降低化療的毒性反應(yīng)，使患兒增加了對化療的耐受性。本研究在隨訪期間聯(lián)合組患兒有效率及疾病控制率(73.3%，93.3%)均較對照組(67.7%，80%)有一定比例提高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這可能與病例數(shù)少，隨訪時間短有關(guān)。

本研究中，對照組治療后外周血中CD4+在化療后出現(xiàn)明顯下降(P＜0.05)，CD8+則升高，使CD4+/CD8+比值下降。這與腫瘤治療的相關(guān)文獻結(jié)論一致，一般認為其原因可能是與腫瘤組織釋放的一些可溶性物質(zhì)或免疫抑制因子有關(guān)［16］。這些物質(zhì)經(jīng)血循環(huán)入胸腺后抑制T細胞分化成熟，并誘導(dǎo)T細胞向有利于抑制性T細胞方向分化，從而造成 T細胞亞群 CD3+、CD4+下降，CD8+升高，使CD4+/CD8+比值變小，從而導(dǎo)致細胞免疫功能低下［17］。聯(lián)合組 CD4+、CD3+CD56+比例在治療后有所增高，CD8+略有降低，但無統(tǒng)計學(xué)意義。這與成人實體腫瘤應(yīng)用 CIK細胞治療后 CD4+、CD3+CD56+比例顯著增高，CD8+顯著降低不同［18，19］。出現(xiàn)此現(xiàn)象可能因病例過少，此外與CIK細胞輸注后細胞免疫功能的檢測時間延長有關(guān)。多數(shù)報道細胞免疫檢測時間為CIK細胞輸注后2周，本研究檢測時間是CIK輸注后4周。因隨著輸注后時間的延長，輸入體內(nèi)的存活CIK細胞數(shù)量逐漸減少，造成CIK治療后CD3+CD56+比例增高無統(tǒng)計學(xué)意義。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞，能抑制T細胞對外源和自身抗原的免疫反應(yīng)，在防止自身免疫性疾病發(fā)生的同時也導(dǎo)致了機體對同源腫瘤細胞的免疫無能。本研究顯示CIK細胞治療后CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞比例顯著降低(P ＜0.05)，與于淵等［20］報道的在卵巢癌患者中使用CIK細胞治療的結(jié)果一致。CIK細胞治療通過下調(diào)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞，可以在一定程度上解除其對機體的免疫抑制，提高腫瘤患兒的免疫功能，預(yù)防局部復(fù)發(fā)及遠處轉(zhuǎn)移。

綜上所述，CIK細胞聯(lián)合化療治療小兒晚期視網(wǎng)膜母細胞瘤具有較好的安全性和初步療效，可以提高緩解率，增強患兒的免疫功能，降低化療的不良反應(yīng)。但由于本治療費用較高，使得該治療在腫瘤患兒中的廣泛應(yīng)用受到一定限制。此外，兒童的治療方案和療效標準尚待進一步統(tǒng)一和規(guī)范。在今后的工作中有待擴大病例及多中心研究來進一步觀察過繼免疫細胞聯(lián)合化療的療效，并深入探討其作用機制。

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Efficacy and safety of cytokine－induced killer cells(CIK cells)combined with chemotherapy in treating advanced retinoblastoma(RB)

MIAO Lixia1，LI Ming2，WANG Yafeng1，SUN Yanfeng1，WANG Jun1，YUAN Hailian1，LI Yanshan1，LIU Hongyan1，and LIU Qiuling1.1.Pediatric Department;2.Office of Medical Affairs，the General Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces，Beijing 100039，China

ObjectiveTo study the efficacy and safety of cytokine－induced killer cells(CIK cells)combined with chemotherapy in treating advanced retinoblastoma(RB).Methods Thirty child patients with RB at stage D were enrolled for the study.15 patients

chemotherapy(control group)while the rest were treated with CIK cells infusion combined with chemotherapy(study group)，from whom 10－35 ml autologous peripheral blood was taken before chemotherapy to culture CIK cells in vitro for about 10 days.CIK cells were reinfused every other day three times.The vital signs in the process of cell reinfusion were observed.Changes of peripheral blood indexes，biochemical indexes，immunity indexes，life quality and side effects were also monitored four weeks after the reinfusion.Results (1)CIK cells reinfusion was safe.15 patients received a total of 46 cycles of CIK cells therapy.Vital signs of all the children were stable.During the 46 courses(138 times)of CIK cells reinfusion，only three cases of patients had a fever during the first 24 hours.No patients had any allergic reactions.With regard to liver and kidney functions and cardiac enzymes，no obvious difference was observed before and after the reinfusion.(2)During the follow－up period，the efficiency and disease control rate in the study group(73.3% ，93.3%)seemed to be higher than that in the control group(67.7%，80%)，but not significantly different.There was improvement in physical strength，appetite and immunity indexes(P ＜0.05)in the study group.The change in the ratio of CD4+CD25+T cells was significant.Conclusions The autologous CIK cell therapy is safe，which improves clinical symptoms significantly in patients with RB.

CIK cells;advanced retinoblastoma;therapy

劉秋玲，E －mail:wj670@vip.sina.com

R730.5

北京市科委“首都臨床特色應(yīng)用研究”專項課題(Z121107001012055)

苗麗霞，女，1975年出生。碩士，主治醫(yī)師。主要從事兒童血液腫瘤內(nèi)科工作。

100039 北京，武警總醫(yī)院:1.兒科，2.醫(yī)務(wù)部

(2012－05－10收稿 2012－08－02修回)

(責任編輯 梁秋野)