吳曉平 陳繼川 陳煒

老年性聾主要的病理學變化是聽覺神經細胞的凋亡[1～3]，并且可能是外周聽覺系統(tǒng)與中樞聽覺系統(tǒng)功能聯(lián)合降低衰變的結果[4，5]，其病因可能為遺傳性因素與環(huán)境因素的共同作用，其中遺傳因素在老年性聾發(fā)展過程中所起作用的比例約為35%～55%[6]。有關后天環(huán)境因素與老年性聾的關系的研究集中于環(huán)境噪聲[7]、耳毒性藥物[8]、糖尿病[9]、心血管病[10]等等方面，而對環(huán)境因素的研究中注意到許多老年人處于相對封閉的社會生活環(huán)境下，這種情況對老年性聾的發(fā)生發(fā)展是否有促進作用目前未有明確報道。本實驗擬通過將老年性聾動物模型置于封閉環(huán)境中，探討封閉環(huán)境對老年性聾的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物及試劑 無強噪聲暴露史及耳毒性藥物使用史的2月齡(體重15～25 g)、10月齡(體重45～60 g)老年性聾動物模型C57BL/6J小鼠各40只，均為雌性，購于第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所實驗動物中心，SPF級。鼠抗γ-氨基丁酸(GABA)多克隆抗體購于sigma公司，二抗兔抗鼠Dylight及Tunel試劑盒購于江蘇碧云天生物技術研究所,速眠新II購于長春軍事醫(yī)學科學院研究所。

1.2封閉環(huán)境的構建 自制約為0.30 m×0.30 m×0.30 m大小空間的鼠籠，透光透氣，互相遠離并置于安靜環(huán)境，使之不受外來噪聲影響。溫度控制在20～25℃，飲食光線等無特殊干預。除喂食水及清潔鼠籠外，盡量不干擾實驗動物。

1.3實驗方法

1.3.1動物分組及飼養(yǎng) 實驗動物群居飼養(yǎng)1月后分組，將2月齡、10月齡動物各均分為實驗組和對照組，每組20只。將實驗組動物全部單獨置于封閉環(huán)境中，對照組繼續(xù)普通環(huán)境群居飼養(yǎng)，各組動物分別飼養(yǎng)2個月。

1.3.2ABR檢測 實驗組與對照組動物分別于分組前及分組飼養(yǎng)2月后進行ABR檢測，動物均以左耳為測試耳。采用美國智聽公司(intelligent hearing system)Smart EP進行ABR檢測，動物以20%的速眠新II(10 ml/kg)肌肉注射麻醉，麻醉后置隔聲恒溫室內，自制電極連接，以鼻尖為地線，顱頂為記錄電極，左側乳突為參考電極，給聲管置于左側外耳道中，刺激聲為純音(puretoner)，低通1 500 Hz，高通100 Hz，疊加1 024次，刺激重復率11.1次/秒，刺激聲90 dB SPL,以10分貝遞減，閾值附近5分貝遞減，以可引出波III的最小刺激強度為閾值。分別檢測1、2、4、8、16 kHz各頻率反應閾。

1.3.3聽皮層神經元凋亡檢測 動物用20%的速眠新II(10 ml/kg)麻醉后，暴露心臟，剪開右心耳，同時經左心室快速灌注37 ℃ PBS 60～80 ml以沖盡血液，此后先快速灌注4 ℃的4%的多聚甲醛40 ml左右，再緩慢灌注40～60 ml，然后開顱取腦組織，置于上述灌注液中，4 ℃保存，24小時后修剪標本。聽皮層的定位參照The Mouse Brain in stereotaxic coordinates圖譜，取聽皮層組織，沿冠狀面常規(guī)方法制作冰凍切片，片厚10 μm ，切片間隔20 μm，每個標本取10張切片，隨機抽取5張，0.3% Triton，37 ℃，15 min，山羊血清封閉，37 ℃，30 min；加入一抗鼠抗GABA(濃度為1:400)，4 ℃孵育24 h；Dylight(濃度為1:100)37 ℃孵育1 h，在每兩個步驟中間都用PBS洗3遍，每遍5 min，此后按tunel說明書操作檢測凋亡情況。激光共聚焦顯微鏡觀察拍照，細胞核被染成紅色為凋亡的聽皮層細胞，胞漿呈藍色為聽皮層GABA能神經元，胞核呈紅色而胞漿呈藍色為聽皮層凋亡的GABA能神經元，任選5個聽皮層視野計數(shù)并取平均值。

1.4統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對資料進行數(shù)據分析,兩組均數(shù)比較用t檢驗(P<0.05有統(tǒng)計學意義)。

2 結果

2.1ABR檢測結果 不同年齡的實驗組各頻率ABR閾反應閾與對照組相比明顯提高，尤其以高頻(8、16 kHz)明顯(P<0.05或P<0.01)；2、10月齡實驗組各頻率反應閾明顯高于分組前(P<0.01)，而2月齡對照組在16 kHz、10月齡對照組在4、16 kHz的反應閾均較分組前升高(P<0.05)(表1)。

表1 各組ABR不同頻率反應閾比較

注：與同齡對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與同齡分組前比較，#P<0.05，##P<0.01

2.2各組聽皮層GABA能神經元凋亡數(shù) 2月齡實驗組的聽皮層GABA能神經元數(shù)與對照組無差異(P>0.05)，而凋亡的細胞數(shù)及凋亡的GABA能神經元數(shù)增多，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。10月齡實驗組GABA能神經元數(shù)明顯少于對照組(P<0.01)，而凋亡的聽皮層細胞個數(shù)明顯多于對照組(P<0.01),而由于10月齡實驗組GABA能神經元已大量凋亡，許多已不能被驗出，故殘存的凋亡GABA能神經元數(shù)偏少(圖1，表2)。

表2 各組GABA能神經元、凋亡的聽皮層細胞及凋亡的GABA能神經元數(shù)(個/視野，

注：與同月齡對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

圖1 Tunel法檢測聽皮層GABA能神經元的凋亡(激光共聚焦顯微鏡 ×800)

3 討論

C57BL/6J小鼠是一種具有先天性遺傳缺陷的老化動物模型，具有與人類相似的聽覺衰退現(xiàn)象，故常被用于老年性聾的研究[11，12]，因此本研究選擇G57BL/6J小鼠來進行實驗以模擬人類社會生活環(huán)境尤其是封閉環(huán)境對老年性聾的影響。對老年性聾的外部環(huán)境研究發(fā)現(xiàn)不同年齡段的C57BL/6J小鼠聽力損失程度不同，性別的差異也影響聽力損失水平[13，14]；所以，本研究選擇了不同年齡階段的同性別的動物；而為了更好的模擬老年人生活環(huán)境的變化，先將所有實驗動物群居飼養(yǎng)了1個月后再分組分別予以封閉環(huán)境和普通環(huán)境飼養(yǎng)，結果顯示在置于封閉環(huán)境后，實驗組動物活動減少，對刺激的敏感性下降，ABR反應閾比對照組提高，并且呈現(xiàn)出與年齡呈正相關。

目前發(fā)現(xiàn)老年性聾患者聽覺功能衰退主要表現(xiàn)為言語區(qū)功能障礙，故認為中樞聽覺系統(tǒng)病變?yōu)橹饕∫?。聽皮層中GABA能神經元含量豐富，本實驗的結果顯示聽皮層GABA能神經元凋亡程度越重，其聽功能受損程度越嚴重，說明聽皮層GABA能神經元凋亡是老年性聾的重要病理因素。

目前公認的影響老年性聾最為重要的環(huán)境因素是噪聲，此外，其發(fā)病率因地區(qū)環(huán)境、生活狀況、飲食習慣及性別因素而不同，且受地區(qū)差異及許多未知因素如文化習俗、飲食習慣、精神壓力及測試標準等影響，因而各時期各地區(qū)關于老年性聾發(fā)病率的報道各異。鄭宏等[15]于1997年報道老年聾無論城鄉(xiāng)均存在明顯的地區(qū)差異，且同一地區(qū)城鄉(xiāng)之間也存在差異；陳曦等[16]報道廣東省老年性聾發(fā)病率農村(73.3%)高于城市(26.7%)；劉民等[17]報道北京老年性聾發(fā)病率城市(48.23%)稍高于農村(41.63%)。這些流行病學資料間接說明患者所處的社會生活環(huán)境對老年性聾的重要影響。而現(xiàn)在存在普遍的社會現(xiàn)象是許多老年人由于疾病、喪偶、退休失業(yè)、子女外出工作等原因，其生活單調枯燥，缺乏正常的社交活動，對新事物的認知接受能力及意愿均減退，容易產生失落感和孤獨感等情緒，與其它人群相比，其社會生活空間狹小封閉，尤其是在一些偏僻農村地區(qū)。封閉環(huán)境對老年性聾的發(fā)生發(fā)展是否有影響，值得探討。從文中結果看，置于封閉環(huán)境后，實驗組動物與分組前及同齡對照組比較其聽皮層的GABA能神經元數(shù)目減少，凋亡程度增加，聽功能減退，尤其在8、16 kHz高頻區(qū)表現(xiàn)明顯(P<0.01)。而處于開放環(huán)境中的2月齡對照組動物與分組前聽功能比較，除在16 kHz反應閾升高外(P<0.05),其余頻率無明顯差異，而2月齡實驗組各頻率ABR反應閾均較同月齡對照組及分組前明顯升高；10月齡對照組與分組前相比，在4、16 kHz反應閾升高(P<0.05)，而實驗組各頻率ABR反應閾較同月齡對照組及分組前明顯升高，由此可證明封閉環(huán)境可導致聽皮層GABA能神經元凋亡，進而導致聽功能下降，并且對高頻聽功能影響明顯。另外，本研究經Tunel法檢測聽皮層細胞凋亡時發(fā)現(xiàn)，2、10月齡實驗組細胞凋亡數(shù)均高于對照組，說明封閉環(huán)境也能促進聽皮層除GABA能神經元以外的其它細胞的凋亡，而這種其它細胞的凋亡是否與聽功能下降有關，除了GABA能神經元外還有哪些細胞與聽功能關系密切，它們與GABA能神經元對聽功能的影響是拮抗作用還是協(xié)同作用等等，都有待于進一步研究。

老年性聾作為一種神經功能退行性病變，其病因非常復雜，本研究為排除其他影響因素干擾，以同樣時間、地區(qū)、相同的年齡、同樣的飲食、同樣的測試標準單純考查封閉環(huán)境對老年性聾發(fā)生發(fā)展的影響，結果證實GABA能神經元凋亡是老年性聾的病理變化；封閉環(huán)境是老年性聾的危險因素，它能促進聽皮層GABA能神經細胞的凋亡，從而加快老年性聾的發(fā)生和發(fā)展。而封閉環(huán)境通過何種機制導致GABA能細胞凋亡，有待于進一步研究。

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