劉志鵬，王旭波，翟介明，張全啟＊＊

（1.中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東青島266003；2.萊州明波水產(chǎn)有限公司，山東煙臺261400）

半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）隸屬于鰈形目（Pleuronectiformes）、舌鰨科（Cynoglossidae）、舌鰨屬（Cynoglossus），俗稱為鰨米、龍利等，為近海溫水性大型底棲魚類，主要在黃海、渤海區(qū)域。半滑舌鰨是一種名貴的海水魚類，由于其肉鮮味美、營養(yǎng)豐富，深受廣大消費(fèi)者歡迎，擁有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和廣闊的養(yǎng)殖前景［1］。隨著近些年來我國北方興起的比目魚養(yǎng)殖熱潮，半滑舌鰨已經(jīng)成為我國海水魚類養(yǎng)殖的主要品種之一。優(yōu)良品種是養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的基礎(chǔ)，但目前對半滑舌鰨的養(yǎng)殖品種缺乏有效地選育，在養(yǎng)殖中的情況并不令人滿意，因此改良現(xiàn)有種質(zhì)資源，提高品種的繁殖、發(fā)育水平，進(jìn)而培育出產(chǎn)量高、抗病強(qiáng)的新品種就成為了推動半滑舌鰨養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵。

魚類多倍體育種是魚類遺傳育種工作的重點(diǎn)研究領(lǐng)域之一，三倍體魚類一般具有不育或低育性［2］，可以在成魚期將二倍體消耗在生殖腺發(fā)育的能量用于生長，克服性成熟帶來的不利影響，減少由于過早成熟造成的產(chǎn)量和質(zhì)量下降，因而能提高肉類質(zhì)量和餌料轉(zhuǎn)換效率［3－4］，可被應(yīng)用于大規(guī)格商品魚培育，例如在加拿大，大規(guī)模的三倍體苗種養(yǎng)殖幾乎遍布全國，他們用三倍體苗種抑制魚類性成熟造成的死亡以及肉質(zhì)下降［5］，因此三倍體育種受到國內(nèi)外水產(chǎn)科學(xué)工作者的廣泛重視。本研究對半滑舌鰨三倍體的培育進(jìn)行了嘗試，使用冷休克法誘導(dǎo)得到了半滑舌鰨的三倍體，并篩選了最佳的誘導(dǎo)條件，為進(jìn)一步開展半滑舌鰨細(xì)胞工程育種提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用魚

實(shí)驗(yàn)所用魚取自萊州明波水產(chǎn)有限公司人工養(yǎng)殖的半滑舌鰨適齡親魚，選取性腺已經(jīng)開始發(fā)育的健康親魚，雌魚體重1.5～2.5 kg，雄魚體重150～300 g，在循環(huán)水養(yǎng)殖車間養(yǎng)殖，控光控溫進(jìn)行催熟，性腺成熟后用GNRH組合催產(chǎn)劑進(jìn)行催產(chǎn)。

1.2 人工授精

選取性成熟的雌雄魚，通過擠壓腹部的方法來采集卵子和精液。收集完畢后將精卵混合均勻，加入海水?dāng)嚢枋诰?，并記錄受精時(shí)間。

1.3 冷休克處理溫度的確定

根據(jù)半滑舌鰨雌核發(fā)育［6］以及預(yù)實(shí)驗(yàn)得到的初步數(shù)據(jù)，設(shè)置2、3、4、5、6、7℃6個(gè)溫度梯度，在受精后4～5 min，將盛有受精卵的篩網(wǎng)放入各梯度海水中進(jìn)行冷休克處理，持續(xù)時(shí)間為20～25 min。每組處理完畢后各取1 000粒受精卵放入單獨(dú)的篩網(wǎng)中在23℃的海水里進(jìn)行孵化，另取1 000粒未處理的受精卵作為對照組。及時(shí)統(tǒng)計(jì)各組的死卵，統(tǒng)計(jì)孵化率并在仔魚孵出后統(tǒng)計(jì)三倍體率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 倍性檢測

參考楊景峰的方法并做稍許改進(jìn)，在仔魚孵化2 d后，取30尾分別加一步法試劑，粉碎魚體解離細(xì)胞，用200目的篩絹過濾細(xì)胞后，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，二倍體對照組初孵仔魚的DNA相對含量設(shè)為100［7］。

1.5 最佳起始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間的篩選

在確定最佳冷休克處理溫度后，將起始時(shí)間分為受精后3、4、5、6、7 min 5個(gè)梯度，在最佳水溫下每個(gè)梯度持續(xù)處理15、20、25、30、35 min。統(tǒng)計(jì)孵化率并在仔魚孵出后統(tǒng)計(jì)三倍體率。

1.6 染色體鑒定

在魚苗發(fā)育至體長10～15 cm左右的時(shí)候，參考周麗清的方法進(jìn)行染色體制片并做稍許改進(jìn)［8］。從魚鰓蓋下沿的腹腔部注射PHA溶液（用0.7%的NaCl配制，終濃度為5 mg／m L）處理3 h，然后在同一位置注射秋水仙素溶液（用0.7%的NaCl配制，終濃度為1 mg／m L）處理1 h，將魚放血取出頭腎，在生理鹽水中進(jìn)行解離并過濾到離心管中，1 000 r／min離心8 min并洗滌細(xì)胞，接著在濃度為0.075 mol／L的KCl中低滲處理30 min后再離心8 min收集細(xì)胞，最后用新配制的預(yù)冷卡諾固定液（無水乙醇∶冰醋酸＝3∶1）固定3次，每次不少于30 min。滴片時(shí)采用冷滴片法，用10%的Giemsa染色30 min，顯微鏡下觀察中期分裂相并拍照，觀察50尾個(gè)體。

2 結(jié)果

2.1 最佳冷休克溫度

在受精后4～5 min，處理20～25 min的相同條件下，6個(gè)不同的冷休克處理溫度與半滑舌鰨平均三倍體率的關(guān)系如圖1所示，在3～6℃的溫度下都有三倍體仔魚孵化，其中4～5℃時(shí)三倍體率最高，在此將4℃確定為最佳處理溫度，此時(shí)三倍體率最高為27.8%，孵化率為5.3%。

圖1 不同冷休克溫度與半滑舌鰨三倍體誘導(dǎo)率的關(guān)系Fig.1 The relationship between the yield of triploid and the temperature of cold shocks in C.semilaevis

2.2 最佳起始時(shí)間和處理時(shí)間

在根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)得到的最佳處理溫度4℃下，起始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間與平均三倍體率（3n）、平均孵化率（H）的關(guān)系如表1所示。各處理組的孵化率均不高，在起始時(shí)間相同的情況下，處理時(shí)間越長，孵化率越低，受精后3和35 min處理時(shí)間的實(shí)驗(yàn)組孵化率為0，而在相同的處理時(shí)間下，孵化率與起始時(shí)間沒有特別明顯的關(guān)系。各處理組的三倍體率也是非常低，其中以受精后5 min為處理起始時(shí)間，20 min為持續(xù)處理時(shí)間獲得的三倍體率最高，雖然在此條件下受精卵的孵化率不是最高的，但考慮到本研究中孵化率都比較低，因此最佳起始時(shí)間為受精后5 min，最佳處理時(shí)間為20 min。

表1 不同處理起始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間對半滑舌鰨三倍體誘導(dǎo)效果Table 1 The triploidy induction result of different starting time and shock duration

2.3 染色體鑒定

染色體觀察結(jié)果（見圖2，圖中箭頭所示為W染色體，標(biāo)尺為5μm）表明，未經(jīng)處理的正常二倍體染色體核型為2n＝42，為ZZ（見圖2A）和ZW（見圖2B），經(jīng)過冷休克處理的三倍體染色體核型為3n＝63，其性染色體有2種類型，分別為ZZZ（見圖2C）和ZWW（見圖2D），證明了它們確實(shí)是半滑舌鰨的三倍體。

3 討論

3.1 誘導(dǎo)方法

人工誘導(dǎo)魚類三倍體常用的有生物、物理、和化學(xué)3種方法，冷休克是一種物理方法，因?yàn)槠洳僮骱啽悖幚砹看竽壳氨粡V泛應(yīng)用。用冷休克誘導(dǎo)三倍體需要確定3個(gè)重要因素：處理開始時(shí)間、處理水溫以及持續(xù)時(shí)間，實(shí)驗(yàn)也表明半滑舌鰨三倍體誘導(dǎo)明顯受到這3個(gè)因素的影響。

魚類三倍體誘導(dǎo)的原理是抑制受精卵第二極體出，在受精卵中多保留一套母本染色體而成為三倍體，所以冷休克起始時(shí)間必須在第二極體排出之前。有的研究把卵從第二次成熟分裂中期到第二極體排出的這段時(shí)間劃分為啟動期、敏感期和不應(yīng)期3個(gè)階段［9］，在敏感期內(nèi)適當(dāng)?shù)奶幚砭湍軐⒌诙O體保留在受精卵內(nèi)，當(dāng)從敏感期進(jìn)入不應(yīng)期后外界處理對抑制第二極體排出失去作用，無法產(chǎn)生三倍體。在本研究中，半滑舌鰨受精卵在受精后5 min誘導(dǎo)的效果最好，說明受精卵正處于敏感期，是抑制第二極體排出的最佳時(shí)期，而起始時(shí)間在受精7 min以后的三倍體率非常低，受精卵已經(jīng)進(jìn)入了不應(yīng)期。大部分魚類的三倍體誘導(dǎo)起始時(shí)間為3～10 min［10］，與本研究結(jié)果相符。第二極體的排出時(shí)間也與受精水溫、卵子成熟程度等有很大關(guān)系，因此在確定處理起始時(shí)間時(shí)還應(yīng)考這些方面的影響。

冷休克處理溫度不應(yīng)過低或過高，最合適的溫度應(yīng)該是其亞致死溫度［11］，過低的溫度會超過受精卵承受的極限，使受精卵大量甚至全部死亡，而過高的溫度又起不到誘導(dǎo)的效果。在本研究中，當(dāng)處理溫度低于4℃時(shí)，胚胎大量死亡，三倍體率也明顯下降，而5和6℃進(jìn)行冷休克的三倍體率也比使用4℃進(jìn)行處理的三倍體率低，說明在亞致死溫度以內(nèi)，溫度越低對第二極體釋放的抑制作用越強(qiáng)。

在起始時(shí)間和處理溫度都確定的情況下，處理時(shí)間會直接影響受精卵的誘導(dǎo)率和孵化率，本研究中處理20 min時(shí)誘導(dǎo)率最高，但隨著處理時(shí)間的延長，誘導(dǎo)率和孵化率都開始下降，直到受精卵全部死亡，過長的處理時(shí)間會對受精卵造成嚴(yán)重?fù)p傷。需要注意的是，同一種魚不同的人用相同的方法進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)也會出現(xiàn)不同的結(jié)果，這可能與試驗(yàn)用魚的地理種群、養(yǎng)殖工藝、性腺成熟度、倍性鑒定方法等因素有關(guān)。

3.2 誘導(dǎo)率和孵化率

在本實(shí)驗(yàn)中，三倍體率與孵化率之間沒有明顯的相關(guān)性，例如在處理溫度較高的6和7℃中或是10 min等處理強(qiáng)度較低的實(shí)驗(yàn)組中，低強(qiáng)度冷處理對受精卵的發(fā)育和分化影響較小，受精卵的孵化率比較高，但在這些實(shí)驗(yàn)組中的三倍體率卻很低甚至為0，而在最佳處理?xiàng)l件下進(jìn)行處理時(shí)其誘導(dǎo)率雖然是最高的，但其孵化率卻不是最高的。

本研究驗(yàn)證了冷休克對半滑舌鰨三倍體的誘導(dǎo)是有效的，在初孵仔魚期的最高三倍體率達(dá)到35%，但與在黑鯛（50%）［12］、大菱鲆（70%）［13］等冷休克誘導(dǎo)的三倍體率相比，半滑舌鰨的誘導(dǎo)率還是比較低。未經(jīng)處理的對照組受精卵孵化率在50%左右，而在經(jīng)過篩選的最佳處理?xiàng)l件下（受精后5 min，4℃下處理20 min）冷休克后的孵化率只有5.5%，經(jīng)觀察，發(fā)現(xiàn)在冷休克處理后，胚胎受到了較大程度的損傷，到原腸期階段就無法繼續(xù)發(fā)育，導(dǎo)致孵化率非常低。與興國紅鯉（50%～70%）［14］、紅鰭東方鲀（80%）［15］等進(jìn)行冷休克誘導(dǎo)三倍體的孵化率相比，半滑舌鰨的孵化率明顯偏低，這可能是因?yàn)榘牖圉嵉氖芫褜Φ蜏負(fù)p傷更為敏感，所以造成了其孵化率大大低于別的魚類。

3.3 三倍體半滑舌鰨的性染色體類型

半滑舌鰨的雌性個(gè)體中被發(fā)現(xiàn)含有1條巨大的異形染色體，經(jīng)推測為W性染色體，進(jìn)而推測半滑舌鰨的性別決定類型是ZZ／ZW型，雌性為配子異型ZW，雄性為配子同型ZZ［8，16］。由此可以推測出通過抑制受精卵第二極體釋放而形成的三倍體，其染色體類型應(yīng)該為ZZZ和ZWW。本研究中進(jìn)行的半滑舌鰨三倍體個(gè)體的染色體制片，經(jīng)過鏡檢后確實(shí)發(fā)現(xiàn)了這2種類型的染色體，且其比例為1∶1，未發(fā)現(xiàn)ZZW型的三倍體個(gè)體。這一結(jié)果說明在半滑舌鰨雌魚減數(shù)分裂中，Z染色體和W染色體之間的交叉互換被嚴(yán)重抑制，半滑舌鰨雌雄個(gè)體之間巨大的形態(tài)差異，除了與W染色體“多余”的遺傳信息相關(guān)外，可能與ZW染色體之間的遺傳信息交流受阻有關(guān)，而這種交換的機(jī)制也恰好是性染色體起源與進(jìn)化的必然途徑。

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