査燕燕 張軍寧 南秀麗 彭 欽 王樹超 劉凱麗 任 朋

早期肺癌大多無癥狀而不為患者所察覺,中晚期肺癌大多數(shù)已不適合手術(shù)或因其它原因不能手術(shù),因而只能選擇放化療。然而臨床治療常發(fā)現(xiàn)不同個(gè)體的NSCLC 患者接受相同放化療方案治療時(shí),在治療療效和耐受性方面有較大的個(gè)體差異。個(gè)體間的差異通常是由于遺傳因素影響所致,X線修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1(X-ray repair cross complementing 1,XRCC1)是參與堿基切除修復(fù)( base-excision repair,BER)的重要因子。因此，我們研究了52例NSCLC患者外周血DNA修復(fù)基因XRCC1 gene Codon399單核苷酸多態(tài)性與NP方案聯(lián)合放療治療Ⅲ期NSCLC近期療效的關(guān)系，探討其預(yù)測放化療效果的可行性。

1 材料與方法

1.1 資料

2009年3月～2011年1月蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院放療科，收治52例初治Ⅲ期NSCLC患者。男性40例，女性12例，年齡30～75歲，中位年齡64歲。參考UICC國際TNM分期標(biāo)準(zhǔn):Ⅲa期40例，Ⅲb期12例。入組條件:①化療前均行全身檢查，入選病例一般狀態(tài)良好，無肺、肝等遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，無重要器官功能障礙；②卡氏評分≥70分。③經(jīng)病理檢查證實(shí)為NSCLC;④化療前血常規(guī)、心電圖及肝、腎功能檢查各項(xiàng)指標(biāo)均未見異常；⑤所有患者均經(jīng)CT檢查證實(shí)具有可測量的腫瘤病灶。

1.2 治療方法

先行誘導(dǎo)化療2個(gè)周期，化療結(jié)束1周后開始放療。化療采用NP方案：長春瑞濱25 mg/m2，第1、8天；順鉑75 mg/m2，第1、2、3天或第1、2、3、4天，3周為1個(gè)周期。

1.3 放療方法

患者均行三維適形或調(diào)強(qiáng)放療，患者取仰臥位，體部熱塑膜固定，Philip 16排CT模擬機(jī)進(jìn)行胸部增強(qiáng)掃描，層厚5 mm。掃描圖像傳輸?shù)椒派渲委熡?jì)劃系統(tǒng)進(jìn)行三維重建，勾畫表面輪廓、GTV、CTV和PTV。腫瘤靶區(qū)根據(jù)ICRU50號和62號報(bào)告定義勾畫靶區(qū)。靶區(qū)勾畫中GTV包括肺原發(fā)灶和引流區(qū)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)，GTV上下方向外放5～15 mm，呼吸移動范圍形成CTV，CTV外放1 cm形成PTV，90%處方劑量包括98%～100% PTV；脊髓最大劑量不超過45 Gy，心臟1/3體積劑量不超過50 Gy，2/3體積照射劑量不超過45 Gy；V20<35%；選擇6MVX線應(yīng)用TPS系統(tǒng)設(shè)計(jì)共面或非共面，適形野4～8個(gè)，靶區(qū)劑量50～70 Gy，常規(guī)分割，分割劑量1.8～2.2 Gy，平均為2 Gy。放療結(jié)束后4周以上評價(jià)療效。

1.4 療效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

采用WHO標(biāo)準(zhǔn)：①完全緩解(complete remission，CR)：可見腫瘤病變完全消失，維持4周以上；②部分緩解(partial remission，PR)：腫瘤最大截面積縮小50%以上，維持4周以上；③穩(wěn)定(stable disease,NR)：腫瘤最大截面積縮小不足50%，或增大不超過25%，維持4周以上；④進(jìn)展(progression disease,PD)：腫瘤最大截面積增大超過25%，或出現(xiàn)新病灶。

1.5 XRCC1 Codon399單核苷酸多態(tài)性檢測

化療前抽取靜脈血5 ml,應(yīng)用多聚酶鏈反應(yīng)-鏈激酶檢測反應(yīng) ( PCR -LDR)技術(shù),檢測XRCC1 Arg399基因型。引物為5′ TCACACCTAACTGGCATCTTCACT 3′和5′CTCCTTCCCTCATCTGGAGTACC 3′。在PCR薄壁管中，配制20 μl多重PCR體系 ：10 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.4)，50 mmol/L KCl,2.0 mmol/L MgCl2，200 mmoL/L dNTPs，0.5 mmol/L Pfimem，1U polymerase;加入 2 μl基因組DNA,充分混勻，于94℃預(yù)變性15 min；94 ℃ 30 s、 58℃ 120 s、64℃ 120 s，共35個(gè)循環(huán)；64℃延伸10 min。再配制20 μl多重LDR體系：20 mmol/L Tris.HCl( pH 8.5)，5 mmol/L MgCl2，100 mmol/L KCl，10 mmol/L DTT，1 mmol/L NAD+，0.2 mmol/L Probes,加入2 μl多重PCR產(chǎn)物，其中上游探針為5′p - GGGAGGGCAGCCGCCGACGCATGCTGCGACACTACGGAGGA-FAM 3′,G探針為5′ACGTGGACAGCTGCAGGGTTGGCGTGT-GAGGCCTTACCTCC 3′,A探針為 5′TTTTTCACAG-ACAGGTCCCAGGGTTGGCGTGTGAGGCCTTACCTCT 3′，充分混勻，然后于94℃預(yù)變性2 min；94℃ 30 s、 50℃ 120 s，共35個(gè)循環(huán)。最后取LDR產(chǎn)物1 μl,應(yīng)用測序儀測出XRCC1基因型。

2 結(jié)果

2.1 近期療效

52例Ⅲ期NSCLC患者,NP方案誘導(dǎo)化療聯(lián)合根治性三維適形或調(diào)強(qiáng)放療后，CR 2例(3.84%)，PR 24例(46.15%)，NR 18例(34.61%)，PD 8例(15.38%)，總有效率 (CR+PR)為50.00%。

2.2 基因分型與近期療效的關(guān)系

52例Ⅲ期NSCLC中，XRCC1基因Codon399分型中，攜帶Arg/Arg、Arg/Gln、Gln/Gln分別有24例(46.15%)、25例(48.08%)、3例(5.77%)，見表1。攜帶XRCC1 Arg/Arg、Arg/Gln+Gln/Gln基因型患者治療有效率分別為54.17%、46.43%，見表2。

表1 52例NSCLC患者的臨床資料(例)

表2 XRCC1基因分型與晚期NSCLC放療敏感性的關(guān)系(例，%)

治療有效組和無效組DNA修復(fù)酶基因頻率分布均符合Hardy Weinberg平衡法則。攜帶Arg/Arg基因型患者與攜帶至少一個(gè)Gln等位基因(Arg/Gln+Gln/Gln)患者有效率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

人類基因組計(jì)劃研究結(jié)果表明,不同個(gè)體的 DNA 99.9%是一樣的,僅存在0.1%的差異,這些差異大部分是基因單核苷酸多態(tài)性。XRCC1是重要的DNA 修復(fù)基因,通過與多聚ADP核糖聚合酶、DNA連接酶Ⅲ及多聚酶β作用,來修復(fù)包括氧化應(yīng)急在內(nèi)的各種損害引起的 DNA損傷[2]。它編碼的蛋白質(zhì)與DNA連接酶Ⅲ相互作用,修復(fù)DNA 單鏈斷裂,并與DNA聚合酶β一起進(jìn)行堿基切除修復(fù),對維持基因組穩(wěn)定十分關(guān)鍵[2]。近年來，隨著人類基因組計(jì)劃的實(shí)施、尤其是單核苷酸多態(tài)性方面的研究成果，為從分子水平根據(jù)個(gè)體的遺傳結(jié)構(gòu)預(yù)測放化療敏感性提供了新的思路。本研究采用 PCR-LDR 技術(shù)，檢測患者外周血DNA 中的 XRCC1基因型,具有方法簡便、 快速的優(yōu)點(diǎn),而且不需要收集癌組織,可以克服未手術(shù)治療的患者、特別是晚期癌癥患者不能取得癌組織的困難,因此具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

王綠化等[3]應(yīng)用PCR-RFLP方法，對136例不可手術(shù)的局部晚期(Ⅲa～Ⅲb期)NSCLC患者外周血白細(xì)胞中基因組DNA的14個(gè)重要基因的27個(gè)功能性SNP位點(diǎn)進(jìn)行了相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，COX2 -1195A/G 位點(diǎn)的GG基因型患者，OS和PFS均優(yōu)于GA或AA基因型患者(OS，P=0.006；PFS，P=0.07)，3種基因型患者中位生存期分別為27.7、17.5和15.7個(gè)月。ATM-111G/A位點(diǎn)GG純合子患者的生存期則明顯短于A等位基因攜帶者(GA+AA)?？梢姡δ苄詥魏塑账岫鄳B(tài)性(SNP)與患者生存時(shí)間顯著相關(guān)。提示SNP可能成為局部晚期NSCLC個(gè)體化治療的分子標(biāo)志物。國內(nèi)有報(bào)道[4]105例接受以鉑類為基礎(chǔ)藥物化療的非小細(xì)胞肺癌患者，研究其XRCC1Arg194Tr-p、Arg399Gln發(fā)現(xiàn)，攜帶至少1個(gè)194Trp等位基因者化療有效率為43.1%，顯著高于攜帶Arg/ Arg基因型者(20.3%)。攜帶399Arg/Arg基因型者化療有效率為41.5%，顯著高于攜帶至少1個(gè)Gln等位基因者(21.2%)。這2個(gè)多態(tài)之間存在聯(lián)合作用，同時(shí)攜帶194Arg/Trp和399Arg/ Arg基因型的患者，治療有效率為66.7%，明顯高于攜帶其它基因型的患者。Giotopoulos等[5]對167例接受輔助放療的乳腺癌患者進(jìn)行XRCCl Codon 399分析發(fā)現(xiàn)，GA基因個(gè)體與放療后毛細(xì)血管擴(kuò)張顯著相關(guān)，且為毛細(xì)血管擴(kuò)張發(fā)生的獨(dú)立因素。

本研究發(fā)現(xiàn)，XRCC1基因Codon399單核苷酸多態(tài)性，與NP方案誘導(dǎo)化療聯(lián)合放療治療Ⅲ期NSCLC的近期療效無明顯相關(guān)性，可能是由于肺癌的發(fā)生是多因素、多階段和多基因過程,是由于環(huán)境危險(xiǎn)因素和個(gè)體遺傳因素交互作用的結(jié)果，僅對某一個(gè)基因或某一個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行研究分析具有一定的局限性[6]，另外本研究樣本量較少，突變型基因頻率低，不足以說明其單核苷酸多態(tài)性與肺癌放化療敏感性的關(guān)系，因此，尤需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本做深入研究，從而為將來個(gè)性化放化療提供依據(jù)。

[1]蔣祝昌.XRCC1與 DNA修復(fù)〔J〕.國外醫(yī)學(xué)生物學(xué)工程分冊,2003,26 (5) ：234.

[2]Skobe M,Hawighorst T,J ackson DG,et al.Induction of tumor lymphangiogenesis by VEGF2C promotes breast cancer metastasis〔J〕.Nat Med,2001,7(2) :192.

[3]王綠化.肺癌的放射治療進(jìn)展〔A〕.孫燕.臨床腫瘤學(xué)進(jìn)展〔C〕.中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社，2006：274～286.

[4]王中華，繆小平，譚 文，等.單核苷酸多態(tài)與晚期非小細(xì)胞肺癌對鉑類藥物化療敏感性的相關(guān)性〔J〕.癌癥，2004，23(8)：865.

[5]Giotopoulos G,Symonds RP，F(xiàn)oweraker K，et al.The late radiotherapy normal tissue in jury phenotypes of telangiect asia,fibrosis and atrophy in breast cancer patients have distinctgenotype dependent causes〔J〕.J Cancer，2007，96(6)：1001.

[6]彭小波，張軍寧.XRCC1單核苷酸多態(tài)性與含鉑類藥物化療對肝腎功能影響相關(guān)性分析〔J〕.實(shí)用癌癥雜志，2011,26(2):147.