諸葛靜

Toll樣受體 4(toll -like receptor,TLR4)是脂多糖的天然受體,在調(diào)節(jié)急性炎癥反應(yīng)、 細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞凋亡中起重要作用。炎癥性組織中都可以檢測(cè)到TLR4的表達(dá)，且不管在病毒感染性疾病組織還是在細(xì)菌感染造成的炎癥疾病組織中都可見TLR4表達(dá)增高[1,2],提示TLR4介導(dǎo)的天然免疫反應(yīng)是炎癥性疾病發(fā)生的起點(diǎn)，同時(shí)TLR4介導(dǎo)細(xì)菌感染性免疫反應(yīng)也可能參與了病毒性炎性病變的發(fā)生，具體機(jī)制并不清楚。我們通過研究TLR4在HPV感染導(dǎo)致的宮頸疾病中的表達(dá)，研究其與HPV感染的相關(guān)的疾病間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 一般資料

研究對(duì)象選自婦科門診及普查中采用TCT發(fā)現(xiàn)的可疑者，再行陰道鏡行宮頸多點(diǎn)活檢病理檢查，診斷為宮頸炎合并HPV感染、CINⅠ期、CINⅡ期、CINⅢ期和宮頸癌的患者。陰道鏡檢測(cè)同時(shí)，取宮頸脫落細(xì)胞進(jìn)行雜交捕獲(Hybridization Capture)HPV DNA分析，確定HPV16感染才記入,所有患者均為新發(fā)患者。每亞組選擇20例，同時(shí)使用健康的宮頸組織(如因子宮肌瘤、宮血等切除子宮)20例作為對(duì)照組。

1.2 方法

將新鮮組織放在液氮中保存，實(shí)驗(yàn)前研磨成粉末后，取0.5 g勻漿研碎組織裂解后提取總RNA，純度A260/A280在1.8～2.2之間，逆轉(zhuǎn)錄后再PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物凝膠電泳后置凝膠成像系統(tǒng)分析。內(nèi)對(duì)照β-actin的mRNA分別與TLR4和HPV16 E7的mRNA在同一體系共同擴(kuò)增，以降低干擾因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。凝膠在圖像系統(tǒng)上分析出所有mRNA的密度后，將β-actin的密度作為內(nèi)對(duì)照，目的基因與內(nèi)對(duì)照的密度之比為目的基因表達(dá)的相對(duì)值。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。TLR4上游引物5'-AATCTAGAGCACTTGGACCTTTCC，下游引物3'-GGGTTCAGGGACAGGTCTAAAGA；E7上游引物5'-ATGAGCAATTACCCGACAGC，下游引物3'-AGCCCATTAACAGCTCTTGC；β-actin上游引物5'-AAGAGAGGCATCCTCACCCT,下游引物3'-TACATGGCTGGGGTGTTGAA。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有的數(shù)據(jù)都輸入SPSS13.0軟件，組間比較采用方差分析，同時(shí)采用了線性相關(guān)分析法。

2 結(jié)果

2.1 TLR4的RNA含量的變化

RT-PCR結(jié)果顯示，從正常宮頸組織，到感染HPV16的宮頸炎性組織，再到CIN組織，最后到宮頸癌組織，TLR4的表達(dá)逐漸增加，對(duì)照組顯著減少(圖1)。經(jīng)灰度值分析，各組的TLR4表達(dá)值見表1 ，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 HPV16 E7 的RNA含量的變化

HPV16 E7在各組中RNA的含量經(jīng)灰度值分析，從正常宮頸到宮頸炎性組織再到宮頸癌，HPV16 E7的表達(dá)有上升趨勢(shì)，但差異經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無顯著意義(表1、圖2)。

表1 TLR4和HPV16 E7基因在各組宮頸組織中的表達(dá)比較

圖1 TLR4基因在各組宮頸組織中的表達(dá)

圖2 HPV16 E7基因在各組宮頸組織中的表達(dá)

2.3 TLR4和HPV16 E7表達(dá)含量的相關(guān)性分析

對(duì)宮頸癌組織中的TLR4和HPV16 E7的基因含量進(jìn)行雙因素相關(guān)分析，結(jié)果為γ=0.121，經(jīng)對(duì)相關(guān)系數(shù)的假設(shè)檢驗(yàn)，P=0.0612,統(tǒng)計(jì)學(xué)上無明顯意義，說明兩者不存在明顯相關(guān)性。

3 討論

宮頸癌是迄今人類所有癌癥中唯一明確病因的癌癥。幾乎所有宮頸癌患者的宮頸組織中，均可以找到高危型人乳頭瘤病毒存在。流行病學(xué)調(diào)查和實(shí)驗(yàn)室研究數(shù)據(jù)均顯示，人乳頭瘤病毒感染是子宮頸癌的主要流行因素，特別是HPV16型高危病毒[3,4]。人體感染HPV后，病毒基因E7或E6可整合到宮頸的上皮細(xì)胞內(nèi)，可能發(fā)生2種轉(zhuǎn)歸：對(duì)于機(jī)體免疫功能正常的人群來講，感染的期限比較短暫，通常8～10個(gè)月會(huì)通過自身免疫系統(tǒng)將病毒清除掉，也就是“一過性感染”。另一種結(jié)局是，機(jī)體免疫系統(tǒng)無力將其清除，致使感染持續(xù)存在，進(jìn)而引起宮頸細(xì)胞的增生、異型性變，最終發(fā)生癌變[5]。那么，機(jī)體在識(shí)別HPV16感染過程時(shí)必然會(huì)激活天然免疫防疫系統(tǒng)。

宮頸癌也經(jīng)歷了宮頸炎性反應(yīng)過程，這種天然的免疫炎性反應(yīng)多有TLRs通路介導(dǎo)，一方面宮頸上皮盡可能識(shí)別感染的HPV病毒并將其清除，另一方面，參與反應(yīng)的許多炎癥趨化因子又可以促進(jìn)宮頸上皮不典型增生，最終甚至癌變。研究表明TLR4在許多皮膚黏膜表面表達(dá)，通過識(shí)別病原微生物激活天然免疫防疫反應(yīng)，調(diào)控致炎因子的釋放，在皮膚及黏膜的免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用[6]。同時(shí)，TLR4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是許多重要疾病的公共通路。

絲裂原活化的蛋白激酶(P44/42MAPK)途徑的活化廣泛地受增殖和炎癥信號(hào)調(diào)控[7]；在單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中，細(xì)菌的脂多糖(LPS)通過模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor，PRR)誘導(dǎo)P44/42的活化，激活NFkB，調(diào)控機(jī)體的炎癥信號(hào)通路。而識(shí)別細(xì)菌LPS的模式識(shí)別受體Toll-like receptor 4(TLR4)在很多疾病中都有高表達(dá)，其調(diào)控的信號(hào)通路不僅可以激發(fā)機(jī)體的先天免疫[8]，同時(shí)對(duì)后續(xù)的繼發(fā)免疫反應(yīng)發(fā)生發(fā)展具有一定的作用。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，TLR4在HPV感染后的宮頸病變中隨著病變嚴(yán)重程度增加，表達(dá)上升，差異有顯著性(F=16.23，P=0.0041)，說明TLR4在宮頸中的表達(dá)與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。而HPV16是宮頸癌的確定致病因素，但其在宮頸病變中的表達(dá)雖隨病變嚴(yán)重程度有升高趨勢(shì)，但差異無顯著性(F=2.13，P=0.0526)，說明HPV16觸動(dòng)了宮頸病變的發(fā)生，但宮頸病變的發(fā)展與HPV的負(fù)荷量不一定相關(guān)。相關(guān)分析的結(jié)果表明，TLR4在宮頸癌中的表達(dá)與HPV無關(guān)(γ=0.121，P=0.0612)，這暗示TLR4信號(hào)通路可能不是介導(dǎo)HPV感染后機(jī)體的天然免疫防疫反應(yīng)路徑。

toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是感知外源性微生物刺激的“哨兵”，TLRs廣泛存在于天然免疫細(xì)胞膜上，與其配體結(jié)合在微生物感染或組織損傷引起的天然免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中起決定性作用。TLRs在正常情況下絕大部分表達(dá)在抗原提呈細(xì)胞表面，如吞噬細(xì)胞(包括巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞)表面。TLR家族中至少有13種成員，迄今為止，發(fā)現(xiàn)人類存在11種TLR成員( TLRl-11)。一般而言，TLR3、7、8和9表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，可以識(shí)別入侵的病毒，而TLR4則識(shí)別入侵的細(xì)菌等[9]。

因此，結(jié)合我們的研究發(fā)現(xiàn)TLR4在HPV相關(guān)的宮頸病變中高表達(dá)，且與HPV16無關(guān)，說明，HPV16雖然是觸動(dòng)宮頸病變發(fā)生發(fā)展的主因，但宮頸癌的發(fā)生可能還有其他病原體感染的參與。這些病原體激活了TLR4信號(hào)通路，觸發(fā)了炎癥反應(yīng)信號(hào)系統(tǒng)，加速了宮頸病變。

[1]Abdul-Careem MF,Firoz Mian M,Gillgrass AE,et al.Fim-H,a TLR4 ligand,induces innate antiviral responses in thelung leading to protection against lethal influenza infection in mice〔J〕.Antiviral Res,2011,92(2):346.

[2]Raicevic G,Najar M,Pieters K,et al.Inflammation and TLR ligation differentially affect the osteogenic potential of human mesenchymal stromal cells (MSC) depending on their tissue origin.〔J〕.Tissue Eng Part A,2012,25.

[3]Lu CB,Yang MJ,Luo L,et al.Detection and typing of human papillomavirus by a GeXP based multiplex PCR assay〔J〕.Zhonghua Shi Yan He Lin Chuang Bing Du Xue Za Zhi,2011,25(1):69.

[4]Dunne EF,Sternberg M,Markowitz LE,et al.Human papillomavirus (HPV) 6,11,16,and 18 prevalence among females in the United States-National Health And Nutrition Examination Survey,2003～2006:opportunity to measure HPV vaccine impact?〔J〕.Infect Dis,2011,204(4):562.

[5]Bowser BS,Alam S,Meyers C.Treatment of a human papillomavirus type 31b-positive cell line with benzo〔a〕pyrene increases viral titer through activation of the Erk1/2 signaling pathway〔J〕.Virol,2011,85(10):4982.

[6]ChausséAM,Grépinet O,Bottreau E,et al.Expression of To-ll-like receptor 4 and downstream effectors in selected cecal cell subpopulations of chicks resistant or susceptible to Salmonella carrier state〔J〕.Infect Immun,2011,79(8):3445.

[7]Bosmann M,Patel VR,Russkamp NF,et al.MyD88-dependent production of IL-17F is modulated by the anaphylatoxin C5a via the Akt signaling pathway〔J〕.FASEB J,2011 25(12):4222.

[8]Kleveta G,Borz?cka K,Zdioruk M,et al.LPS induces phosphorylation of actin-regulatory proteins leading to actin reassembly and macrophage motility〔J〕.Cell Biochem,2012,113(1):80.

[9]Hu J,Lou D,Carow B,et al.LPS regulates SOCS2 transcription in a type I interferon dependent autocrine-paracrine loop〔J〕.PLoS One,2012,7(1):e30166.