姚運(yùn)紅 鄧 巖 胡新榮 高洪彬 唐澤立

鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展涉及眾多基因的甲基化[1]。Ras相關(guān)結(jié)構(gòu)域家族1A(RASSF1A)基因是新近發(fā)現(xiàn)的潛在腫瘤抑制基因[2,3]。在多種腫瘤組織中RASSF1A基因由于基因的突變、缺失或由于啟動(dòng)子區(qū)高甲基化而引起低表達(dá)或不表達(dá)[2～7]。在鼻咽癌中，RASSF1A是常見的甲基化基因之一，但文獻(xiàn)報(bào)道的RASSF1A甲基化情況不一致[2～5,8,9]，目前針對鼻咽細(xì)胞系CNE-2Z的RASSF1A基因甲基化及去甲基化的研究也不多見。本文應(yīng)用去甲基化劑5-氮雜-2′-脫氧胞苷(5-Aza-CdR)處理人低分化鼻咽癌細(xì)胞系CNE-2Z，觀察RASSF1A基因的去甲基化特點(diǎn)及重新表達(dá)的情況及CAN-2Z細(xì)胞的生長和克隆形成能力的改變，旨在探討該基因在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料

CNE-2Z(人低分化鼻咽癌細(xì)胞系)，廣東醫(yī)學(xué)院病理教研室建株并保存。PCR擴(kuò)增儀(9600型，PE公司，USA)，EZ-DNA甲基化試劑盒Gold(D5005，Zymo公司)，5-Aza-CdR(5 mg/支，A3656，sigma公司)，DNA提取試劑盒(北京中杉公司)，PCR Master-mix (KT205-01,Invitrogen公司)，免疫細(xì)胞化學(xué)試劑[鼠抗人RASSF1A單克隆抗體(50 μl,ARF0551,ATGEN公司)、SP-9000通用型試劑盒、PBS緩沖液(2000 ml/包)、抗體稀釋液(ZLI-9028)、DAB顯色試劑盒等均購自北京中杉公司]。RASSF1A基因甲基化特異引物對(M)和非甲基化引物對(U)，含兩組4對，均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。一組序列[6],M1(93 bp):5′-GTGTTAACGCGTTGCGTATC-3′和5′-AACCCCGCGAACTAAAAACGA-3′,U1(105 bp)：5′-TTTGGTTGGAGTGTGTTAATGTG-3′和5′-CAAACCCCACAA-ACTAAAAACAA-3′；二組序列[7]M2(169 bp)：5′-GCTAACAAACGCGAACCG-3′和5′-GGGTTTTGCGA-GAGCGCG-3′，U2(169 bp)：5′-CACTAACAAACACAAACC-3′和5′-GGTTTTTGTGAGAGTGTGTTTAG-3′。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 CNE-2Z 細(xì)胞培養(yǎng) CNE-2Z細(xì)胞系于RPMI-1640培養(yǎng)液中(含10%新生小牛血清，青霉素100 U/ml，鏈霉素100 U/ml，0.056%NaHCO3，調(diào)節(jié)pH值至7.4)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，0.25%胰酶-EDTA消化傳代。

1.2.2 5-Aza-CdR處理實(shí)驗(yàn) 5-Aza-CdR 5 mg，溶解于1 ml PBS緩沖液中，再調(diào)配成1×10-5M(高濃度)和5×10-6M(低濃度)溶液，低溫-60℃～-80℃保存。常規(guī)消化細(xì)胞傳代，培養(yǎng)24 h后加入5-Aza-CdR處理，24 h后更換含5-Aza-CdR的新鮮生長液，培養(yǎng)3天后換成不含5-Aza-CdR的生長液繼續(xù)培養(yǎng)。對照組用PBS代替5-Aza-CdR。

1.2.3 甲基化特異性PCR DNA抽提及亞硫酸氫鹽修飾：收集5-Aza-CdR處理CNE-2Z細(xì)胞和對照組CNE-2Z細(xì)胞，應(yīng)用DNA提取試劑盒和EZ-DNA甲基化試劑盒Gold，并按相應(yīng)的說明書進(jìn)行DNA提取和DNA亞硫酸氫鹽修飾試及純化。

甲基化特異性PCR：反應(yīng)體系25 μL，包括2×Master-mix 12.5 μL、亞硫酸氫鹽修飾DNA 2.5 μL、10 μM正反方向引物各2.5 μL、水5.0 μL。 一組引物反應(yīng)程序[5]：95 ℃預(yù)變性12 min,95 ℃、55 ℃、72 ℃各1 min,40個(gè)循環(huán)，然后72 ℃延伸5 min；二組引物反應(yīng)程序[6]：95 ℃預(yù)變性15 min,94 ℃ 30 s、58 ℃ 40 s、72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，然后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物在3%瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色，應(yīng)用紫外成像儀照相分析。

1.2.4 免疫細(xì)胞化學(xué) 采用SP法進(jìn)行染色，步驟如下：將CNE-2Z細(xì)胞接種在處理好的蓋玻片上，置于6孔板中，培養(yǎng)24 h后加入5-Aza-CdR處理，在實(shí)驗(yàn)各時(shí)間點(diǎn)終止培養(yǎng)取出細(xì)胞爬片，用冷PBS洗5 min×3次，預(yù)冷甲醇-丙酮固定液固定10 min。對照組不用5-Aza-CdR處理。在細(xì)胞爬片上滴加3%甲醇-過氧化氫，室溫孵育10 min，以阻斷過氧化物酶。冷PBS洗5 min×3次，滴加正常山羊血清，室溫孵育10 min，甩去多余血清。滴加鼠抗人單克隆抗體RASSF1A(1∶100比例稀釋)，以PBS代替一抗作為空白對照，4℃冰箱孵育過夜。冷PBS洗5 min×3次，滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育15～25 min，冷PBS洗5 min×3次。滴加鏈霉素親生物素蛋白-過氧化物酶溶液(三抗)，室溫孵育15～25 min，冷PBS洗5 min×3次。DAB顯色，蘇木精輕度復(fù)染，脫水，透明，晾干后樹脂封片。顯微鏡下觀察，以胞質(zhì)著色為陽性。

1.2.5 細(xì)胞生長曲線 把細(xì)胞置于6孔板中培養(yǎng)(1×105/孔)，每天收集6孔細(xì)胞分別計(jì)數(shù)，取其平均數(shù)，連續(xù)計(jì)數(shù)6天后描繪細(xì)胞生長曲線。

1.2.6 平板克隆形成率 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞用5-Aza-CdR處理4天，換新鮮生長液培養(yǎng)2天；對照組細(xì)胞不用5-Aza-CdR處理。把培養(yǎng)細(xì)胞制成800個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，按1 ml/孔加入6孔培養(yǎng)板中，另加1 ml培養(yǎng)液，置37℃、5%培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10天，每組共6孔。10天后，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌，甲醇固定10 min，姬姆薩染色10～20 min。在顯微鏡下計(jì)數(shù)直徑大于50 μm(或者含50個(gè)細(xì)胞以上)的細(xì)胞克隆數(shù)，計(jì)算克隆形成率(%)=每孔克隆形成數(shù)/每孔接種細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用卡方檢驗(yàn)分析平板克隆形成率。

2 結(jié)果

2.1 CNE-2Z細(xì)胞株RASSF1A基因高度甲基化

PCR擴(kuò)增檢測結(jié)果見圖1，兩組引物都擴(kuò)增出甲基化特異性產(chǎn)物，分別是M1(93 bp)和M2(169 bp),但都未擴(kuò)增出非甲基化產(chǎn)物(U1和U2泳道)。說明CNE-2Z細(xì)胞株RASSF1A基因呈高度甲基化。

2.2 經(jīng)5-Aza-CdR處理的CNE-2Z細(xì)胞RASSF1A基因去甲基化情況

選擇第一組PCR引物，對經(jīng)5-Aza-CdR處理CNE-2Z細(xì)胞RASSF1A基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測。CNE-2Z細(xì)胞分別用0 M(作為對照)、5×10-6M和1×10-5M 5-Aza-CdR處理1～4天，第4天后停藥1～2天。以每天為一個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞提取DNA，經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾后進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測。

圖1 未經(jīng)5-Aza-CdR處理CNE-2Z細(xì)胞RASSF1A基因MSP電泳結(jié)果

M1和M2分別為第一、第二組甲基化特異PCR(MSP)產(chǎn)物；U1和U2分別為第一、第二組非甲基化PCR產(chǎn)物

由圖2可見，2種濃度5-Aza-CdR處理第1和第2天的CNE細(xì)胞，與對照組細(xì)胞一樣，僅被擴(kuò)增出甲基化產(chǎn)物，說明RASSF1A基因仍處于甲基化狀態(tài)；處理第3天，2種濃度5-Aza-CdR處理的CNE細(xì)胞都被擴(kuò)增出甲基化產(chǎn)物和非甲基化產(chǎn)物，說明RASSF1A基因部分去甲基化；處理第4天，2種濃度5-Aza-CdR處理的CNE細(xì)胞僅被擴(kuò)增出非甲基化產(chǎn)物，說明RASSF1A基因完全去甲基化；用藥4天后停藥1～2天，5-Aza-CdR處理過的CNE細(xì)胞仍僅被擴(kuò)增出非甲基化產(chǎn)物，說明RASSF1A基因完全去甲基化至少可以保持2天以上。

圖2 經(jīng)5-Aza-CdR處理CNE-2Z細(xì)胞RASSF1A基因的MSP電泳結(jié)果

2.3 經(jīng)5-Aza-CdR處理的CNE-2Z細(xì)胞對RASSF1A的作用

未經(jīng)5-Aza-CdR處理和經(jīng)5-Aza-CdR處理1～2天后的CNE-2Z細(xì)胞，經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)檢測到RASSF1A表達(dá)。經(jīng)5-Aza-CdR處理的CNE-2Z細(xì)胞，第3天RASSF1A呈弱表達(dá)，第4天呈較強(qiáng)表達(dá)，第4天后停藥1～2天，仍檢測到呈明顯表達(dá)，與RASSF1A基因去甲基化狀態(tài)吻合。

2.4 經(jīng)5-Aza-CdR處理的CNE-2Z細(xì)胞生長情況

圖3 5-Aza-CdR處理4天后CNE-2Z細(xì)胞生長曲線

5-Aza-CdR處理4天后更換不含5-Aza-CdR的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞6天描繪細(xì)胞生長曲線。對照組為未加5-Aza-CdR的CNE-2Z細(xì)胞。由圖3可見，用藥第1天兩組細(xì)胞增殖速度就明顯較對照組慢，對照組第2天出現(xiàn)倍增，用藥兩組倍增出現(xiàn)在第2～3天，低濃度組和高濃度組第1～2天差異不明顯，第3天出現(xiàn)差異，高濃度組增殖速度較低濃度組緩慢，但不明顯。

圖4 5-Aza-CdR處理4天后停藥2天CNE-2Z細(xì)胞生長曲線

5-Aza-CdR處理4天后停藥2天，更換不含5-Aza-CdR的培養(yǎng)液培養(yǎng)6天描繪細(xì)胞生長曲線。對照組為未加5-Aza-CdR的CNE-2Z細(xì)胞。由圖4可見，第1天3組增殖情況無顯著差異，第2天用藥兩組增殖速度較對照組稍慢，第3天后用藥組增殖速度明顯較對照組緩慢，用藥兩組間差異不明顯。

2.5 經(jīng)5-Aza-CdR處理的CNE-2Z細(xì)胞平板克隆形成率

對照組CNE-2Z細(xì)胞培養(yǎng)7天即可見克隆形成，而1×10-5M 5-Aza-CdR處理組細(xì)胞此時(shí)未見克隆形成。實(shí)驗(yàn)組和對照組克隆形成率分別為5.4%和10.8%(χ2=14.62,P<0.05)，表明5-Aza-CdR處理CNE-2Z細(xì)胞的克隆形成率較對照組顯著降低。

3 討論

CNE-2細(xì)胞是人低分化鼻咽癌細(xì)胞系和研究鼻咽癌多方面生物學(xué)特性的很有用的細(xì)胞模型。有研究者用砒霜處理CNE-2細(xì)胞可以誘導(dǎo)Rassf1a基因去甲基化和表達(dá)升高[10]，提示CNE-2細(xì)胞的Rassf1a 基因處于甲基化狀態(tài)。還有研究者直接用去甲基化劑5-Aza-CdR處理CNE-2細(xì)胞，用MSP檢測到非處理細(xì)胞和低濃度5-Aza-CdR處理細(xì)胞的Rassf1a基因的甲基化特異性和非特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，提示CNE-2細(xì)胞的Rassf1a 基因處于半甲基化狀態(tài)[8,11]。本組用MSP僅檢測到CEN-2Z細(xì)胞的Rassf1a基因的甲基化特異性產(chǎn)物，表明Rassf1a基因呈完全甲基化狀態(tài)，與文獻(xiàn)[8,11]報(bào)道的不完全一致。產(chǎn)生半甲基化的原因是該基因在部分細(xì)胞中完全甲基化而在另一部分細(xì)胞中非甲基化，或在同一個(gè)細(xì)胞中的一個(gè)等位基因甲基化而另一個(gè)等位基因非甲基化，使甲基化特異性引物和非特異性引物都得以擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物。此外，在實(shí)驗(yàn)過程中對樣本DNA的亞硫酸氫鹽修飾不徹底，未能將全部的甲基化的C轉(zhuǎn)變?yōu)閁→T時(shí)，也可擴(kuò)增出甲基化特異性和非特異性PCR產(chǎn)物。至于CNE-2Z細(xì)胞的Rassf1a基因是完全甲基化還是半甲基化有待更多的研究證實(shí)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CNE-2Z細(xì)胞經(jīng)5-Aza-CdR處理后，第1～2天RASSF1A基因仍呈完全甲基化狀態(tài)，第3天部分去甲基化，第4天后全部去甲基化，停止5-Aza-CdR處理后2天仍保持完全去甲基化狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)比以往文獻(xiàn)[8,11]更詳細(xì)描述了經(jīng)5-Aza-CdR處理后的CNE-2Z細(xì)胞RASSF1A基因的去甲基化規(guī)律，對進(jìn)一步研究RASSF1A基因影響鼻咽癌細(xì)胞的生物學(xué)行為及其機(jī)制提供了實(shí)用基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果同時(shí)也說明在鼻咽癌中RASSF1A基因被5-Aza-CdR誘導(dǎo)去甲基化后停藥其去甲基化狀態(tài)可持續(xù)至少2天以上的時(shí)間并發(fā)揮抑癌作用，為研究針對RASSF1A基因甲基化的治療鼻咽癌的新方法提供了線索。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CNE-2Z細(xì)胞經(jīng)5-Aza-CdR處理后，RASSF1A基因蛋白表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞生長和克隆形成能力顯著抑制。提示RASSF1A基因可能是鼻咽癌的抑癌基因，其在鼻咽癌中失活的機(jī)制可能是高度甲基化。但是，由于5-Aza-CdR是非選擇性的去甲基化劑，可能同時(shí)使許多鼻咽癌的抑癌基因包括Rassf1a、14-3-3σ、DAPK等基因去甲基化[8,10～13]。因此，5-Aza-CdR處理導(dǎo)致CNE-2Z細(xì)胞的生物學(xué)行為改變，是眾多抑癌基因去甲基化的綜合結(jié)果，還不足以說明是Rassf1a的直接作用，而要說明Rassf1a基因?qū)Ρ茄拾┚哂兄苯右种谱饔茫枰O(shè)計(jì)其他實(shí)驗(yàn)，這將是本研究小組的下一步的研究工作。

張文靜等[14]用5-Aza-CdR處理鼻咽癌細(xì)胞系5-8F細(xì)胞后觀察蛋白質(zhì)組學(xué)的改變，鑒定了33個(gè)表達(dá)差異的基因，其中15個(gè)基因的蛋白表達(dá)水平上調(diào)。在上調(diào)的基因中并不包含Rassf1a基因。也許不同的細(xì)胞，盡管都是鼻咽癌細(xì)胞，其基因背景不同，可導(dǎo)致基因的甲基化譜的不同，這是在研究時(shí)值得注意的問題。

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