王運賢，田淑貞，李留霞，趙 萍

(1.南陽醫(yī)學高等?？茖W校婦產(chǎn)科教研室，河南南陽 473061；2.河南省腫瘤醫(yī)院放療科，河南鄭州 450008；3.鄭州大學第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，鄭州 450052)

宮頸癌作為女性最常見的惡性腫瘤之一，浸潤性宮頸癌的5年生存率為67%，早期癌的5年生存率為90%，而原位癌則幾乎達100%[1]，因此早期診斷宮頸癌是提高宮頸癌患者生存率的關(guān)鍵。人乳頭狀瘤病毒(HPV)檢測及液基細胞薄層涂片技術(shù)(TCT)的應(yīng)用對提高宮頸癌的早期診斷率發(fā)揮了重要作用。近年來研究表明，腫瘤相關(guān)抗原(TAAs)在腫瘤尤其惡性腫瘤發(fā)生早期即可在腫瘤細胞異常表達而刺激機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生自身特異性抗體[2-3]，檢測患者血清中腫瘤自身抗體對早期診斷肝癌、肺癌、卵巢癌等腫瘤具有重要意義[4-6]。由于宮頸癌病變接近體表，易于通過細胞學檢測及宮頸活檢確診，但是宮頸癌病變應(yīng)具有與其他器官腫瘤相似的生物學特性，腫瘤細胞是否也能刺激機體產(chǎn)生免疫學反應(yīng)，至今尚未見到有關(guān)宮頸癌患者血清TAAs自身免疫抗體檢測的報道。本研究擬通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測宮頸癌及癌前病變患者血清中的7種自身抗體，分析各單一抗原及不同抗原組合在宮頸癌患者中檢測的陽性率，探討TAAs在檢測宮頸癌方面的價值。

1 資料與方法

1.1一般資料

1.1.1標本來源 采集2008年7月至2010年7月鄭州大學第一附屬醫(yī)院收治的45例宮頸癌患者和40例宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)患者的血清標本；40例健康者血清來自健康志愿者和體檢檢查結(jié)果正常的健康成人。所有血清標本均存放于-80 ℃低溫冰箱。

1.1.2分組 宮頸癌組：宮頸癌患者術(shù)前血清共計45例，患者年齡26～74歲，平均45.02歲。其中腺癌患者7例，鱗癌患者38例。按FIGO臨床分期：Ⅰ期癌患者25例，Ⅱ期、Ⅲ期癌患者20例。CIN組：CINⅡ和Ⅲ級患者術(shù)前血清40例，患者年齡24～54歲，平均年齡39.87歲。上述兩組患者均經(jīng)病理證實。對照組：健康人血清40例，年齡23～76歲，平均年齡50.97歲。

1.2主要試劑 7種TAAs Koc、CDK2、Survivin、C-myc、p16、CyclinB1和CyclinE均來自美國德州大學生命科學系分子流行病學實驗室。Sunrise酶標儀為美國Tecan 公司產(chǎn)品。

表1 單一抗原抗體檢測陽性率結(jié)果[n(%)]

Sur:Survivin;CycB1:CyclinB1;CycE:CyclinE

表2 不同TAA組合的檢測結(jié)果的評價[n(%)]

96孔酶標板為Gibico公司產(chǎn)品。其他試劑如四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，二抗為辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgG(HRP-Aps)等均由鄭州大學蛋白質(zhì)組學應(yīng)用研究中心實驗室饋贈。

1.3方法 采用間接ELISA[7]，各種抗原均以0.5 μg/μL的稀釋濃度包被96孔板，4 ℃孵育24 h棄液，3%明膠封閉1 h；一抗待測患者血清以1∶50稀釋后每孔加100 μL，磷酸緩沖液 (PBS)作為空白對照，37 ℃孵育1 h，PBST洗板3次；二抗HRP-APs以1∶4 000稀釋每孔加100 μL，37 ℃孵育1 h，PBST洗板3次；最后每孔加TMB過氧化氫尿素顯色液100 μL，37 ℃ 避光反應(yīng)至顯色充分后加終止液(10%硫酸)每孔50 μL，立即在自動酶標儀上讀取450 nm OD值，空白孔調(diào)零。結(jié)果判定：每份待測血清做兩孔取其平均值，以健康人血清OD的平均值加2個標準差作為界值即截斷值(Cut off)，高于此值判為陽性，低于此值判為陰性。

1.4統(tǒng)計學處理 采用SPSS18.0統(tǒng)計學軟件進行分析，采用χ2檢驗分析各組中陽性表達率，均以α=0.05為檢驗水準，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1單獨檢測一種抗原抗體的陽性率結(jié)果 單獨檢測血清中一種抗原抗體，在45例宮頸癌患者中陽性率為22.2%～53.3%，以Koc為最高，p16最低；40例CIN患者中陽性率為10.0%～30.0%,以Koc為最高，CDK2最低；對照組陽性率均相應(yīng)的低于宮頸腫瘤組，見表1。

2.2不同抗原組合的檢測結(jié)果及診斷宮頸癌的真實性評價 隨著TAA組合種類的增加，宮頸癌診斷的靈敏度上升到73.3%，明顯高于健康人；而特異度也達到82.5%，僅降低了12.5%，陽性預測值和陰性預測值也達82.5%和73.3%，約登指數(shù)(靈敏度+特異度-1)為0.558，陽性似然比[靈敏度/(1-特異度)]為4.18，見表2。

2.37種TAAs檢測結(jié)果 檢測結(jié)果顯示宮頸癌組、CIN組和對照組的陽性率存在總體差異(χ2=26.590，P<0.05)，兩兩比較結(jié)果，宮頸癌組陽性率明顯高于CIN組，兩組間差異有統(tǒng)計學意義(χ2=7.083、P<0.05)；宮頸癌組、CIN組陽性率均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(χ12=26.498，P1<0.05；χ22=7.040，P2<0.05)，見表3。

2.47種TAAs檢測宮頸癌的陽性率在組織學類型和臨床分期上的差異 7種TAAs檢測陽性率在宮頸鱗癌、腺癌之間差異無統(tǒng)計學意義(χ21=0.650，P1>0.05)；CIN與宮頸癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期間差異均有統(tǒng)計學意義(χ12=4.539，P1<0.05；χ22=4.848，P2<0.05)；宮頸癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期間差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.051，P>0.05)，見表4。

表3 7種TAAs聯(lián)合檢測結(jié)果

表4 不同病理類型和臨床分期檢測的結(jié)果

3 討 論

有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者血清中存有各種類型的抗腫瘤細胞抗原抗體[8]，腫瘤相關(guān)抗原抗體系統(tǒng)作為腫瘤早期診斷的分子標志物已成為國內(nèi)外腫瘤研究領(lǐng)域的熱點。對不同腫瘤的研究顯示，單一抗原檢測某一腫瘤自身抗體時陽性率較低，敏感度和特異度難以滿足臨床需要[9]，聯(lián)合檢測一組精心挑選的抗原抗體可以提高腫瘤早期診斷的靈敏度，同時為使抗原聯(lián)合檢測在臨床應(yīng)用中達到一定的真實性，不同類型的腫瘤可能需要不同的抗原抗體組合[10-11]。Survivin、p16、CyclinE、CDK2等蛋白均已被證實與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤轉(zhuǎn)移相關(guān)[12-15],它們在內(nèi)在性質(zhì)、作用環(huán)節(jié)、作用機制上不完全相同，但存在內(nèi)在關(guān)聯(lián)，可協(xié)同促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和浸潤轉(zhuǎn)移，有一定的聯(lián)合基礎(chǔ)。

本研究用7種TAAs檢測宮頸癌，單獨檢測1種抗原抗體時靈敏度較低，最高的Koc為53.3%，最低的p16為22.2%，說明上述7種抗原單獨應(yīng)用時診斷價值不大。隨著TAAs組合種類增加，診斷的靈敏度從22.2%上升到73.3%，增加了51.1%，而特異度從95.0%下降到82.5%，只降低12.5%?？傮w看，7種TAA微陣列檢測結(jié)果較為理想，陽性和陰性預測值也達82.5%和73.3%，約登指數(shù)0.558，陽性似然比4.18，提示7種TAAs聯(lián)合檢測宮頸癌具有一定的臨床價值。檢測45例宮頸癌患者及40例CIN患者血清中TAAs抗體，宮頸癌組陽性率明顯高于CIN組，兩者間差異有統(tǒng)計學意義 (P<0.05)，且宮頸癌組、CIN組血清抗體陽性率均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.5)，提示7種TAAs聯(lián)合檢測對宮頸癌的診斷具有一定的參考價值，且說明在宮頸癌前病變期患者血清中已存在TAAs自身抗體的變化，可對宮頸癌的早期診斷起到預警作用。進一步研究顯示，CIN組與宮頸癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期間陽性率差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但是宮頸癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，說明7種TAAs檢測陽性率與宮頸癌的期別無相關(guān)性，與癌變具有相關(guān)性，提示血清中免疫學變化在腫瘤發(fā)生早期已出現(xiàn)，該檢測方法對宮頸癌的早期診斷具有一定參考價值。另外，分析不同病理類型的宮頸癌TAAs檢測結(jié)果顯示，鱗癌與腺癌之間差異無統(tǒng)計學意義，說明7種TAAs檢測陽性率與宮頸癌病理類型無明顯相關(guān)。

綜上所述，本研究運用ELISA方法檢測宮頸腫瘤患者血清中的自身抗體，獲得了較有價值的結(jié)果，提示TAAs在早期診斷宮頸癌方面可能具有一定參考價值。

[1]郎景和.迎接子宮頸癌預防的全球挑戰(zhàn)與機遇[J].中華婦產(chǎn)科雜志,2002,37(3)：129-131.

[2]Porter LA,Singh G,Lee JM.Abundance of cyclin B1 regulates gamma-radiation-induced apoptosis[J].Blood,2000,95(8):2645-2650.

[3]Groisman I,Waizenegger IC,Bunz F,et al.CPEB,maskin,and cyclin B1 mRNA at the mitotic apparatus:implications for local translational control of cell division[J].Cell,2000,103(3):435-447.

[4]任鵬飛，劉會娟，閆平平，等.多種腫瘤相關(guān)抗原聯(lián)合檢測原發(fā)性肝癌的診斷價值評價[J].第四軍醫(yī)大學學報，2009,30(19)：1989-1992.

[5]閆平平,王鵬,劉會娟,等.聯(lián)合檢測多種腫瘤相關(guān)抗原抗體在肺癌早期診斷中的作用[J].第四軍醫(yī)大學學報,2008,29(24):2278-2280.

[6]Li L,Wang K,Dai L,et al.Detection of autoantibodies to multiple tumor-associated antigens in immunodiagnosis of ovarian cancer[J].Mol Med Report,2008,1(4):589-594.

[7]Zhang JY,Casiano CA,Peng XX,et al.Enhancement of antibody detection in cancer using panel of recombinant tumor-associated antigens[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2003,12(2):136-143.

[8]Roxanne M,Shi FD,Peng XX,et al.Autoimmune response to anti-apoptotic protein survinvin and its association with antibodies to p53 and c-myc in cancer detection [J].Cancer Detect Prev,2005,29(3):241-248.

[9]Shi FD,Zhang JY,Liu DR,et al.Preferential Humoral Immune Response in Prostate Cancer to Cellular Proteins p90 and p62 in a Panel of Tumor-Associated Antigens [J].Prostate,2005,63(3):252-258.

[10]Zhang JY.Mini-array of tumor-associated antigen to enhance autoantibody detection for immunodiagnosis of hepatocellular carcinoma[J].Autoimmun Rev,2007,6(3):143-148.

[11]Tan EM,Zhang J.Autoantibodies to tumor-associated antigens:Reporters from the immune system[J].Immunol Rev,2008,222:328-340.

[12]Lee JP,Chang KH,Han JH,et al.Survivin,a novel antiapoptosis inhibitor,expressionin uterine cervical cancer and relation ship with prognostic factors[J].Gynecol Cancer,2005,15(1):113-119.

[13]Bahnassy AA,Zekri AR,Alam El-Din HM,et al.The role of cyclins and cyclins inhibitors in the multistep process of HPV-associated cervical carcinoma[J].Egypt Natl Canc Inst,2006,18(4):292-302.

[14]Kim YT,Zhao M.Aberrant cell cycle regulation in cervical car cinoma [J].Yonsei Med,2005,46(5):597-613.

[15]惠燕，黃利鳴，葉紅.survivin在人宮頸癌前病變和宮頸浸潤癌組織中的定量分析及其臨床價值的評估[J].腫瘤防治研究，2008，35(1)：39-42.