于 泓，袁良東#，鐘正霞，姚觀平，余麗梅，徐尚福，吳 芹

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎內(nèi)科 563003;2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院貴州省細胞工程重點實驗室 563003；3.遵義醫(yī)學(xué)院貴州省基礎(chǔ)藥理重點實驗室，貴州遵義 563003)

痛風(fēng)是嘌呤代謝障礙引起的代謝性疾病，其臨床主要表現(xiàn)為高尿酸血癥、急性關(guān)節(jié)炎反復(fù)發(fā)作、痛風(fēng)石沉積、慢性關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)畸形及功能障礙、腎實質(zhì)退行性病變甚至尿毒癥。隨著人們生活水平的不斷提高，飲食結(jié)構(gòu)和生活習(xí)慣的改變，其發(fā)病率呈上升趨勢，已成為危害人類健康的常見病。目前，主要采用秋水仙堿等控制急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎(acute gouty arthritis，AGA)發(fā)作癥狀，但復(fù)發(fā)率高,發(fā)癥難控制，治療藥物不良反應(yīng)較大[1-4]。

尿酸結(jié)石導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)發(fā)生是AGA發(fā)病的主要機制之一，腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)和白介素-6(IL-6)等炎癥因子是引起關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因子，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)的紅、腫、疼痛。秋水仙堿、糖皮質(zhì)激素等通過減少炎性介質(zhì)生成或阻斷炎性因子作用，從而緩解AGA臨床癥狀[5]。

抗痛風(fēng)膠囊(anti-gout capsule，AGC)以祛風(fēng)通絡(luò)的中醫(yī)學(xué)理論為基礎(chǔ)配制而成，由烏梢蛇、桃仁、紅花、枸杞、木瓜、桂圓等中藥組成，民間用于治療AGA，緩解關(guān)節(jié)炎癥及疼痛效果顯著。本研究主要在評價抗痛風(fēng)膠囊治療AGA療效的同時，檢測TNF-α在AGA大鼠血清、關(guān)節(jié)液和關(guān)節(jié)組織中的變化情況，探討抗痛風(fēng)膠囊的抗炎作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1藥物與試劑 AGC由遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎內(nèi)科提供，0.5 g/粒；秋水仙堿(西雙版納版納藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn))，每片0.5 mg(批號 20100502)。尿酸鈉結(jié)晶(批號 100982303)購于美國Sigma公司， TNF-α ELISA檢測試劑盒購于上海西唐生物科技有限公司。吐溫80等其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.1.2主要儀器 YLS-TA型足爪容積測量器購于山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站，通用酶標(biāo)儀和KDC-2044低速冷凍離心機分別為美國BIO-RAD公司和科大創(chuàng)新股份有限公司產(chǎn)品。

1.1.3動物 健康雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量240～250 g,第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實驗動物中心提供，SPF級動物合格證號 SEXK(渝)2007-00050。實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d。

1.2方法

1.2.1實驗分組 大鼠稱體質(zhì)量、編號，隨機分為5組，每組10只，即空白組、模型組、陽性藥物組、AGC低劑量、AGC高劑量組。于造模前、后測量大鼠足爪容積，每天測量1次；制備AGA模型同時，每天灌胃給藥一次，連續(xù)5 d，空白組和模型組給予等容積(1 mL/100 g)生理鹽水，陽性藥物組給予秋水仙堿0.8 mg/kg，AGC組則分別給予AGC 0.3 g·kg-1·d-1、1.2 g·kg-1·d-1。第5天灌胃2 h后處死大鼠，留取標(biāo)本，-80 ℃低溫冰箱保存待用。

1.2.2AGA大鼠模型制備[6-7]除空白組外，其余大鼠均腹腔注射10%水合氯醛0.3 mL/100 g麻醉，仰臥位固定，右踝關(guān)節(jié)局部消毒，以其外側(cè)后方為穿刺點，穿刺進入踝關(guān)節(jié)腔，向關(guān)節(jié)腔注入0.2 mL尿酸鈉溶液(尿酸鈉結(jié)晶250 mg加0.9%氯化鈉注射溶液45 mL，再加5 mL吐溫80，加熱攪拌，配制成尿酸鈉溶液50 mL)，以關(guān)節(jié)囊對側(cè)鼓起為注入標(biāo)準(zhǔn)?？瞻捉M注射等容積生理鹽水。

1.2.3步態(tài)行為學(xué)評分[8]觀察模型制備后24～48 h AGA大鼠步態(tài)變化。評分標(biāo)準(zhǔn)：0分為正常步態(tài)；1分為輕度跛行，受試下肢略彎曲；2分為中度跛行，受試下肢剛觸及地面；3分為重度跛行，受試下肢離開地面，三足著地行走。

1.2.4關(guān)節(jié)容積測定 實驗前與AGC治療前后，用足趾容器測量大鼠足趾容積，以反應(yīng)足踝關(guān)節(jié)容積，連續(xù)監(jiān)測大鼠關(guān)節(jié)容積的變化。

1.2.5TNF-α含量測定 AGA大鼠連續(xù)灌胃給藥治療5 d處死，取腹主動脈血2 mL，離心、分離血清，備用。另在踝關(guān)節(jié)上方0.5 cm處剪下含踝關(guān)節(jié)的足爪，去皮膚后足爪縱切，放入5 mL生理鹽水，4 ℃浸泡過夜，留取上清液1 mL。按照試劑盒說明書，采用ELISA法測定光密度值，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計算血清和關(guān)節(jié)液中TNF-α含量。

2 結(jié) 果

2.1一般狀態(tài) 實驗期間可見空白組和AGC組大鼠皮毛白而光澤。反應(yīng)靈敏，飲食及尿便正常。模型組精神、飲食尚可,大小便正常，但體毛稍欠光澤，秋水仙堿組大鼠體毛欠光澤，精神欠佳，懶動，食量減少，少數(shù)大鼠出現(xiàn)大便稀溏。

2.2AGC對大鼠步態(tài)變化的影響 與空白組比較，模型組大鼠步態(tài)評分值明顯升高(P<0.01)，活動減少，右下肢彎曲，行走時出現(xiàn)不同程度的跛行，以模型制備后24～48 h變化明顯。與模型組比較，秋水仙堿組和AGC各組大鼠活動狀態(tài)得到顯著改善，評分顯著降低(P<0.01)，見表1。

表1 AGC對大鼠步態(tài)變化的影響

表2 AGC對大鼠關(guān)節(jié)容積的影響

表3 AGC對大鼠血清TNF-α含量的影響

2.3AGC對大鼠關(guān)節(jié)腫脹度的影響 以足趾容積變化反應(yīng)踝關(guān)節(jié)容積，其值增加表示關(guān)節(jié)腫脹度增大，結(jié)果可見，除空白組外，注射尿酸鈉結(jié)晶各組，1～5 d，大鼠的踝關(guān)節(jié)容積均明顯高于注射前水平(P<0.01)，存在不同程度的關(guān)節(jié)腫脹，且關(guān)節(jié)腫脹度隨時間延長，有不同程度的減輕(表2)。與空白組比較，模型組大鼠關(guān)節(jié)容積顯著增加(P<0.01)。與模型組比較，AGC低、高劑量組和秋水仙堿組關(guān)節(jié)容積均明顯降低，但仍高于治療前水平。

表4 AGC對大鼠關(guān)節(jié)液中TNF-α含量的影響

2.4AGC對大鼠血清和關(guān)節(jié)液中TNF-α含量的影響 給藥治療5 d，TNF-α含量測定結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組大鼠血清和關(guān)節(jié)液中TNF-α含量均明顯升高(P<0.05)，經(jīng)秋水仙堿和低、高劑量AGC治療后，與模型組比較，AGA大鼠血清和關(guān)節(jié)液中TNF-α含量明顯降低(表3、4)，且抗痛風(fēng)膠囊與秋水仙堿組TNF-α含量無顯著差異。

3 討 論

大鼠后足踝關(guān)節(jié)注射尿酸鈉結(jié)晶制備AGA模型，已被廣泛用于痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎治療藥物的研究，所引起的癥狀和病理變化與人體AGA的臨床表現(xiàn)極為相似[9]，TNF-α、IL-1β等炎性因子參與了尿酸鈉誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)組織免疫炎癥反應(yīng)[10-12]。一般認(rèn)為中性粒細胞、內(nèi)皮細胞黏附是急性痛風(fēng)產(chǎn)生的本質(zhì)，而TNF-α等可上調(diào)內(nèi)皮細胞選擇素活性，增加中性粒細胞的募集，使內(nèi)皮細胞和中性粒細胞表面的黏附分子相結(jié)合，浸潤關(guān)節(jié)部位，釋放炎性介質(zhì)，引起關(guān)節(jié)局部炎癥反應(yīng)的發(fā)生。因而降低AGA患者關(guān)節(jié)局部TNF-α水平，可減少或終止炎性因子的惡性循環(huán)，是AGA治療的有效措施之一。TNF-α水平的變化既可能反應(yīng)關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)的輕重，也是AGA發(fā)病的機制，已被用于治療痛風(fēng)藥物療效評價的重要檢測指標(biāo)之一[13-15]。此外，TNF-α還可通過誘導(dǎo)前列腺素等致痛物質(zhì)釋放，產(chǎn)生致痛效應(yīng)。因而減少局部的TNF-α，也可一定程度地緩解局部疼痛。

本實驗中，大鼠注射尿素鈉結(jié)晶24～48 h，已出現(xiàn)明顯的踝關(guān)節(jié)紅、腫及步態(tài)異常，與文獻報道一致[9]，產(chǎn)生了AGA的癥狀和體征，表明AGA模型制備成功。給予AGC和秋水仙堿治療后48 h，AGA大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹程度已開始減輕，大鼠步態(tài)也有所改善，治療5 d，上述癥狀基本消除，關(guān)節(jié)腫脹程度也減輕70%～90%。表明AGC和秋水仙堿對尿素鈉結(jié)晶引起的AGA具有明顯治療作用。有研究報道[16]，AGC中的烏梢蛇具有祛風(fēng)、通絡(luò)止痙，烏梢蛇體富含的烏梢蛇Ⅱ型膠原蛋白，可明顯抑制滑膜細胞炎性因子的水平和活性；木瓜、桃仁等則具有抗血凝、溶栓、解熱鎮(zhèn)痛等作用[17-18]，上述藥物的共同作用，可能是AGC對AGA產(chǎn)生良好治療作用的基礎(chǔ)。

AGA模型組大鼠血清和關(guān)節(jié)液中TNF-α含量明顯升高，說明循環(huán)和局部TNF-α水平的升高與AGA的發(fā)病關(guān)系密切，是重要致炎因子。AGC在迅速緩解AGA大鼠關(guān)節(jié)腫脹的同時，還將異常增高的血清和關(guān)節(jié)液TNF-α水平降至正常范圍，表明下調(diào)循環(huán)和關(guān)節(jié)局部TNF-α水平是AGC發(fā)揮治療作用的主要機制之一，從而有效阻斷TNF-α引起的炎癥瀑布級聯(lián)及網(wǎng)絡(luò)效應(yīng)，明顯減輕關(guān)節(jié)局部的炎癥反應(yīng)和關(guān)節(jié)損傷。然而，AGC是否還可調(diào)節(jié)IL-1β等其他炎性因子的水平，或通過其他途徑減輕關(guān)節(jié)損傷，還需要進一步深入研究。

總之，AGC可迅速緩解AGA大鼠踝關(guān)節(jié)的腫脹，改善其步態(tài)異常，其作用機制與顯著降低血清和關(guān)節(jié)液中TNF-α的含量，減少炎癥損傷有關(guān)。

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