吳劍平，顧欣，李丹妮，嚴(yán)鳳，張鑫

（上海市獸藥飼料檢測所，上海 201103）

毛細(xì)管電泳法檢測牛奶中硫氰酸鈉質(zhì)量濃度

吳劍平，顧欣，李丹妮，嚴(yán)鳳，張鑫

（上海市獸藥飼料檢測所，上海 201103）

運用毛細(xì)管區(qū)帶電泳法直接檢測牛奶中硫氰酸鈉質(zhì)量濃度。前處理使用乙睛沉淀蛋白，中性氧化鋁SPE柱除去部分水溶性維生素、氨基酸，離心脫脂。在NaH2PO4-Na2B4O7緩沖液中加入溴化十四烷基三甲基溴化銨（TTAB）作為電滲流反相作用劑，分離電壓20 kV，分離溫度30℃，電極反向，以二極管陣列紫外檢測器218 nm波長下分析樣品，質(zhì)量濃度范圍在5～500 mg/L內(nèi)線性較好，r＞0.9995。該方法可適用于生鮮乳和巴氏滅菌成品乳，檢測限可達(dá)到0.2 mg/kg，定量范圍0.5～50 mg/kg，精確度＜10%，回收率＞90%。

硫氰酸鈉；毛細(xì)管區(qū)帶電泳法；電滲流反向作用劑

0 引言

在2008年12月，衛(wèi)生部發(fā)布的《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑名單（第一批）》中明確規(guī)定硫氰酸鈉屬于違法添加物質(zhì)，硫氰酸鈉的主要毒性來自于硫氰酸根離子，硫氰酸根離子是強極性陰離子，使用普通的高效液相色譜法較難進(jìn)行分離測定。由于毛細(xì)管電泳的分離模式多樣化，毛細(xì)管內(nèi)壁的修飾方法及流動的緩沖液中的添加劑的不同，以及新檢測技術(shù)的發(fā)展，使毛細(xì)管電泳的應(yīng)用非常廣泛。尤其是在分析具有強極性的陰離子和陽離子領(lǐng)域，比傳統(tǒng)的色譜學(xué)方法有著更好的分析效果。本文建立了毛細(xì)管電泳檢測牛奶中硫氰酸鈉含量的方法。

1 實驗

1.1 儀器與試劑

BECKMAN COULTER毛細(xì)管電泳系統(tǒng)（PA-800 PLUS DEMO，32KARAT工作站）；電子天平（Mettler AE240，瑞士）；高速冷凍離心機(jī)（Allegra X-22R，BECKMAN COULTER）；減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（B-490，BUCHI）；十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱（Agela-ASBC18，250 mm×4.6 mm，5 μm）；堿性氧化鋁SPE固相萃取柱（Agela-Cleanert,1 000 mg×6 mL）；硫氰酸鈉（98.5%）；NaH2PO4H2O NaH2PO4H2O（分析純）；Na2B4O7（色譜純）；H3PO4（分析純）；正丙醇（分析純）；去離子水（自制，電阻率＞10 MΩ·cm）。

1.2 方法

1.2.1 NaH2PO4-Na2B4O7緩沖液制備

分別稱取量NaH2PO4H2O 0.3120 g，Na2B4O70.2012 g置50 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，倒入燒杯中，逐滴加入H3PO4調(diào)節(jié)pH值至7.00±0.02后加入TTAB 0.42 g搖勻后超聲溶解，制得緩沖溶液，抽濾后備用。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液與標(biāo)準(zhǔn)工作溶液制備

取硫氰酸鈉對照品2.50 g，置250 mL容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，搖勻，得1 g/L標(biāo)準(zhǔn)貯備液。分別精密量取該標(biāo)準(zhǔn)貯備液1.00，2.00，5.00，10.00，20.00，50.00，100.00 mL置200 mL容量瓶中用1.2.1所制得磷酸鹽緩沖液定容至刻度，搖勻，即得5，10，25，50，100，250，500 mg/L標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.3 儀器條件

新毛細(xì)管首次使用時依次在0.14 MPa壓強下用甲醇沖洗5 min，去離子水沖洗5 min，濃度為1 mol/L的HCl沖洗5 min，去離子水沖洗5 min，濃度為0.1 mol/L的NaOH沖洗5 min，去離子水沖洗5 min，1.2.1緩沖液沖洗5 min，加20 kV電壓平衡30 min。

運行間依次在0.14 MPa壓強下用濃度為0.1 mol/L的NaOH沖洗5 min，去離子水沖洗5 min，1.2.1緩沖液沖洗5 min。進(jìn)樣時壓強0.003 MPa，進(jìn)樣時間5 s；分離中，分離溫度30℃，分離電壓-20 kV，躍遷時間0.5 min，檢測波長218 nm。

運行后依次在20 psi壓強下用濃度為0.1 mol/L的NaOH沖洗5 min，去離子水沖洗5 min，空氣吹干后保存毛細(xì)管。

1.2.4 前處理方法

精密量取樣品10.00 g，置50 mL具塞離心管中，加入乙睛15 mL，密塞強烈振搖提取3 min后，至高速冷凍離心機(jī)中，4℃下8 000 r/min離心3 min，小心取出全部上層清液，過中性氧化鋁SPE柱，擠干，收集全部流出液于100 mL梨型瓶中，加入1 mL正丙醇，置60℃恒溫水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，精密加入1.00 mL的1.2.1中緩沖液，振蕩溶解后，取出置2 mL的TIP離心管中，14 000 r/min離心3 min脫脂后取水層溶液過0.22 μm濾膜，待測。

2 結(jié)果

2.1 方法的檢測限與定量限

在1.2.3儀器條件下，對空白溶液、標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣品溶液進(jìn)行實驗，結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明，硫氰酸鈉的理論塔板數(shù)不低于5 000，主峰與雜質(zhì)峰的分離度大于2.0，拖尾因子小于1.5。結(jié)果表明，該色譜條件適用于牛奶中的硫氰酸鈉的質(zhì)量濃度測定，根據(jù)實驗結(jié)果3倍信噪比計算可得其儀器檢測限為1 mg/L，10倍信噪比計算可得其定量限為3.3 mg/L。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

分別精密量取該標(biāo)準(zhǔn)貯備液1.00，2.00，5.00，10.00，20.00，50.00，100.00 mL置200 mL容量瓶中用1.2.1中所制得緩沖液定容至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度5，10，25，50，100，250，500 mg/L標(biāo)準(zhǔn)工作溶液序列。分別經(jīng)過0.22 μm濾膜過濾后上機(jī)測定，按1.2.3中的儀器條件操作，每個濃度分別反復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜峰面積均值，以標(biāo)準(zhǔn)曲線序列工作液質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，峰面積（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)工作曲線A=314.89C-508.49，R=0.9997，回歸曲線如圖2所示。結(jié)果表明，該方法進(jìn)樣質(zhì)量濃度在5～500 mg/L范圍內(nèi)線性良好。

2.3 回收率實驗

取生鮮乳3批（批號：A-滬浦20110512-09，B-滬奉20110518-01，C-滬寶20110427-08），巴氏滅菌乳（D-三島鮮牛奶20110510，E-光明學(xué)生奶20110505）各取10.00 mL，分別添加5，10，20 μL質(zhì)量濃度為1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，按1.2.4前處理方法進(jìn)行預(yù)處理，按1.2.3的儀器條件進(jìn)行檢測，所得結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明，該方法的準(zhǔn)確度和精密度都符合要求。

表1 回收率測定結(jié)果（n=6）

取批號滬浦20110512-09的生鮮乳按1.2.4中的前處理方法制得樣品溶液。取該溶液于分別于室溫下保存0，4，8，12，24 h后以1.2.3儀器方法進(jìn)行測定，NaSCN峰面積的RSD分別為0.97%。實驗結(jié)果表明，樣品溶液中硫氰酸鈉在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

通過PA800 PLUS的3D全波長掃描圖譜可知，硫氰酸根離子在218 nm處具有最大吸收，并且此處的背景基線噪音也相對較小，因此選擇218 nm作為檢測波長。

3.2 緩沖鹽的選擇

直接法紫外檢測硫氰酸鈉要求背景的紫外吸收要盡可能低，同時也要求緩沖液有一定的pH值調(diào)節(jié)范圍，并在該pH值范圍內(nèi)有足夠的緩沖容量。本研究分別嘗試了Tris-HCl，H3BO3-Na2B4O7，NaH2PO4-Na2B4O73種緩沖液體系，其分離結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，使用NaH2PO4-Na2B4O7緩沖液體系時硫氰酸根離子可以被較好的分離。

3.3 緩沖液濃度的選擇

電滲淌度受緩沖液濃度的增加而減少，對目標(biāo)化合物的出峰時間和峰型的對稱性都有影響，本研究嘗試了NaH2PO4∶Na2B4O7=20∶10（濃度比，下同），NaH2PO4∶Na2B4O7=40∶20，NaH2PO4∶Na2B4O7=100∶50，NaH2PO4∶Na2B4O7=200∶100，上述緩沖體系中都加入了濃度為50 mmol/L的TTAB作為電滲流反向劑。實驗結(jié)果表明，當(dāng)緩沖液濃度比在40∶20以下時，隨著提高緩沖液濃度，硫氰酸鈉出峰時間縮短，但當(dāng)濃度比達(dá)到40∶20以上時出峰時間沒有明顯變化，而容易造成毛細(xì)管柱的堵塞現(xiàn)象。

圖4中，曲線1為NaH2PO4∶Na2B4O7=20 mmol/L∶10 mmol/L；曲線2為NaH2PO4∶Na2B4O7=40 mmol/L∶20 mmol/L

3.4 緩沖液pH值的選擇

pH值變化可導(dǎo)致毛細(xì)管內(nèi)表面的Si-OH電離發(fā)生變化，因此電滲流（EOF）受pH值影響較大，本研究在pH值為3～10范圍內(nèi)嘗試了pH=3.50±0.02，pH= 7.00±0.02，pH=9.50±0.02 3種不同的pH值對硫氰酸鈉出峰時間和峰型對稱性的影響，結(jié)果如圖5。由圖5可以看出，當(dāng)調(diào)節(jié)pH=7.00±0.02時硫氰酸鈉的峰型對稱性較好，且與雜質(zhì)分離較好,分析時間也較短。

3.5 凈化方法的選擇

牛奶中干擾硫氰酸鈉檢測的主要雜質(zhì)為蛋白質(zhì)、脂肪、氨基酸和水溶性維生素，因此凈化方法考慮主要能除去這些干擾物質(zhì)。通過加乙睛可以使牛奶中的大部分蛋白質(zhì)變性，發(fā)生絮凝，然后通過高速冷凍離心機(jī)4℃下8 000 r/min離心3 min，使絮凝的蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀，同時也可使部分的脂肪層與水相分離，離心后的提取液中還含有大量氨基酸和水溶性維生素以及部分蛋白質(zhì)，若直接進(jìn)樣檢測雜峰干擾較嚴(yán)重，因此選擇了中性氧化鋁的固相萃取柱進(jìn)行凈化，嘗試對批號為20110505的巴氏成品乳凈化后與未凈化的樣品進(jìn)行進(jìn)樣測定，所得色譜圖如圖6所示。結(jié)果表明，中性氧化鋁柱可以取得較好對牛奶提取液中的氨基酸和水溶性維生素的吸附效果較好，相比未凈化的圖譜中目標(biāo)峰后沒有雜質(zhì)干擾,所測得添加回收結(jié)果大于90%,因此可以應(yīng)用在凈化方法中。

3.6 毛細(xì)管電泳法與高效液相色譜法測定比較凈化方法的選擇

之前曾對離子對高效液相色譜法測定牛奶中的硫氰酸鈉進(jìn)行過研究,在此使用該方法對5種不同樣品分別使用兩種方法進(jìn)行了測定,其中高效液相色譜方法具體為：色譜柱：Agela-ASB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為磷酸鹽緩沖液（磷酸2.00 mL置1 000 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，倒入燒杯中，逐滴加入三乙胺調(diào)節(jié)pH值至7.00±0.02）︰乙睛＝95︰5；柱溫為30℃；流速為0.8 mL/min；檢測波長為218 nm；進(jìn)樣量10 μL，前處理方法與本法相同。每種樣品分別進(jìn)行1 mg/kg的添加回收測定試驗，將兩種方法的測定結(jié)果進(jìn)行了比較，結(jié)果如表2所示。由表2可以看出，毛細(xì)管電泳法所測得結(jié)果與高效液相色譜法所測得結(jié)果基本一致。

表2 毛細(xì)管電泳法與高效液相色譜法測定比較結(jié)果表（n=6）

4 結(jié)論

以上實驗結(jié)果表明，該方法操作簡便易行，方法的準(zhǔn)確性、重復(fù)性均較好，可用于生鮮乳和巴氏成品乳中硫氰酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)檢測。其檢測限和定量限都能達(dá)到和高效液相色譜相同的質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平，而且前處理方法簡便，檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

[1]朱明華.儀器分析[M].北京：高等教育出版社,2000：70-71.

[2]牟世芬，劉克納，丁曉靜.離子色譜方法及應(yīng)用.2版[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.

[3]王丹慧,高娃,李梅.原料乳中硫氰酸鈉摻假定性檢測方法[J].中國乳品工業(yè),2008,36(7):57-58.

[4]吳劍平,顧欣.高效液相色譜法檢測牛奶中硫氰酸鈉質(zhì)量濃度[J].中國乳品工業(yè),2011,39(7):44-46.

Determination of sodium thiocyanate in milk by CE

WU Jian-ping,GU Xin,LI Dan-ni,YAN Feng,ZHANG Xing
(Shanghai Institute for Veterinary Drug&Feedstuffs control，Shanghai 201103，China)

A method to determinate sodium thiocyanate in milk by CE was established.The separation was performed on NaH2PO4-Na2B4O7with TTAB used as the electro-osmotic flow(EOF)modifier to change the direction of EOF.The detection wavelength was 218 nm.The separate votege was 20 kV and the separate temperature was 30℃.Good linearity was showed within the range of 5～500 mg/L respectively, r＞0.9995.The average recoveries was larger than 90.0%respectively,RSD＜10%.The method was simple,rapid and reliable for the simultaneous determination of sodium thiocyanate in milk with the LOD of 0.2 mg/kg and the determination range of 0.5～50 mg/kg.

sodium thiocyanate﹔CE﹔EOF modifier

TS252.7

A

1001-2230（2012）03-0053-04

2011-10-09

吳劍平（1983-），男，畜牧師，研究方向為殘留測定。