孔慶洋，林葉，李慶章

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030）

乙酸鈉和丁酸鈉對(duì)奶牛乳腺脂肪酸合成相關(guān)基因的影響

孔慶洋，林葉，李慶章

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030）

采用熒光定量RT-PCR方法，探討了外源添加乙酸鈉和丁酸鈉，對(duì)乳腺上皮細(xì)胞中乳脂肪酸合成的關(guān)鍵酶基因的影響，并采用半自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)了添加乙酸鈉和丁酸鈉后培養(yǎng)體系中三?；视蜐舛鹊淖兓?，確定了體外調(diào)控乳脂肪酸生物合成的最佳乙酸鈉濃度為16 mmol/L，最佳丁酸鈉濃度為0.75 mmol/L，為人工調(diào)控乳成分的合成提供了理論依據(jù)。

乙酸鈉；丁酸鈉；乳脂肪酸合成；FAS；ACC

0 引言

乳腺脂代謝的重要調(diào)節(jié)發(fā)生在mRNA水平，其中乙酰輔酶a羧化酶（ACC）是脂肪酸內(nèi)源合成途徑的限速酶，脂肪酸合酶（FAS）是一種多功能復(fù)合酶，對(duì)控制動(dòng)物體脂沉積具有重要的意義。目前，很多研究都集中在添加日糧或用動(dòng)靜脈物質(zhì)濃度差和血流量的方法,來(lái)調(diào)控乳脂的合成[2],但國(guó)內(nèi)外在mRNA水平上研究添加乙酸和丁酸對(duì)乳脂合成的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究乙酸鈉和丁酸鈉對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞兩種脂肪酸合成關(guān)鍵酶ACC和FAS在mRNA水平的影響和對(duì)乳脂合成能力的作用，旨在篩選出調(diào)控乳脂肪生物合成的最佳前體物濃度，為進(jìn)一步提高乳質(zhì)量和乳產(chǎn)量提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定

取泌乳期乳腺組織塊，置于含有培養(yǎng)液的小瓶中，在超凈臺(tái)上分離修剪，洗凈血凝塊，盡量剝離實(shí)體組織和結(jié)締組織，將呈白色顆粒狀的腺泡組織盡量剪碎，置于I型膠原酶中，37℃消化3.5～4 h，400目篩網(wǎng)過(guò)濾，D-Hank’s液清洗濾出液直至上清液無(wú)混濁物，將細(xì)胞沉淀以適量的密度接種于培養(yǎng)瓶中，于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[3]。乳腺細(xì)胞從組織塊周?chē)L(zhǎng)，單層細(xì)胞融合至培養(yǎng)瓶底壁90%左右，吸出原有培養(yǎng)液，根據(jù)上皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶消化敏感性不同純化乳腺上皮細(xì)胞[4,5]。應(yīng)用免疫熒光細(xì)胞染色法檢測(cè)純化后乳腺上皮細(xì)胞中角蛋白18的表達(dá)情況，激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.2.2 乙酸鈉和丁酸鈉的添加

待穩(wěn)定培養(yǎng)24 h的細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80%時(shí)開(kāi)始在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加不同濃度的乙酸鈉和丁酸鈉，乙酸鈉濃度設(shè)定為：0，4.0，8.0，12.0，16.0，20.0mmol/L，每組3個(gè)平行；丁酸鈉濃度設(shè)定為0，0.25，0.5，0.75，1.0，1.25mmol/L，每組3個(gè)平行[6]。培養(yǎng)24h后收集乳腺上皮細(xì)胞和培養(yǎng)液，分別進(jìn)行熒光定量RT-PCR檢測(cè)和甘油三酯濃度測(cè)定。

1.2.3 mRNA水平表達(dá)的檢測(cè)

采用TRlzol試劑提取乳腺上皮細(xì)胞中總RNA，使用甲醛變性凝膠電泳的方法檢測(cè)RNA可用，使用Primer5.0進(jìn)行PT-PCR法檢測(cè)所需要的引物設(shè)計(jì)（表1）。RNA經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄后使用TaKaTa公司的SYBRPrime-ScriptTMEx TagTM試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，溶解曲線分析，每個(gè)基因進(jìn)行3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以軟件導(dǎo)出，采用2-△△ct相對(duì)定量方法進(jìn)行計(jì)算。

表1 引物序列

1.2.4 胞外三?；视偷臏y(cè)定

按照說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)溶液，以546 nm為主波長(zhǎng)測(cè)定吸光度，根據(jù)公式：三油甘脂濃度=（A樣品÷A校準(zhǔn)）×標(biāo)準(zhǔn)濃度，計(jì)算三酰基甘油濃度。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)表示為平均值（X）±標(biāo)準(zhǔn)誤（SE）。

2 結(jié)果

2.1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定

本研究選取泌乳期荷斯坦奶牛乳腺組織，通過(guò)組織塊培養(yǎng)法進(jìn)行乳腺上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)，每2 d換1次培養(yǎng)液，培養(yǎng)至10 d左右乳腺組織塊周?chē)霈F(xiàn)乳腺上皮細(xì)胞（圖1）。

應(yīng)用免疫熒光方法檢測(cè)純化后的乳腺上皮細(xì)胞中角蛋白18的表達(dá)，激光共聚焦顯微鏡觀察。結(jié)果顯示：乳腺上皮細(xì)胞中角蛋白18的表達(dá)呈陽(yáng)性（圖2）。綠色熒光為表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中的角蛋白18，紅色為PI染色的細(xì)胞核。

2.2 添加乙酸鈉對(duì)基因表達(dá)及TG合成的影響

采用熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)乳腺上皮細(xì)胞中羧化酶（ACC）和FAS mRNA的表達(dá)，采用半自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)培養(yǎng)體系中TG濃度的變化，結(jié)果如表2所示。與未添加丁酸鈉的乳腺上皮細(xì)胞相比，當(dāng)乙酸鈉濃度為16 mmol/L時(shí)，乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)脂肪酸合酶（FAS）基因表達(dá)量增加437%，ACC基因表達(dá)量增加727%，乳腺上皮細(xì)胞分泌的TG增加30%（P＜0.05）。

2.3 添加丁酸鈉對(duì)基因表達(dá)以及TG合成的影響

表3為不同濃度丁酸鈉對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞FAS、ACCmRNA表達(dá)及TG合成的影響。由表3可以看出，與未添加丁酸鈉的乳腺上皮細(xì)胞相比，當(dāng)丁酸鈉濃度為0.75 mmol/L時(shí)，F(xiàn)AS基因表達(dá)量增加432%，ACC基因表達(dá)量增加720%，乳腺上皮細(xì)胞胞外分泌的TG增加27%（P＜0.05）。

表2 不同濃度乙酸鈉對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞FAS、ACCmRNA表達(dá)及TG合成的影響

表3 不同濃度丁酸鈉對(duì)基因表達(dá)及TG合成的影響

3 討論

在乳腺中，乳脂的合成發(fā)生在乳腺上皮細(xì)胞滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的表面。乳脂合成中所需的C4～C10脂肪酸100%由乳腺上皮細(xì)胞從頭合成，因此脂肪酸從頭合成的原料乙酸和丁酸對(duì)泌乳期奶牛的乳脂合成尤為重要。乙酸和丁酸是由瘤胃合成后進(jìn)入血液的主要揮發(fā)性脂肪酸，經(jīng)乳腺吸收后被乳腺上皮細(xì)胞用來(lái)重新合成短鏈脂肪酸，進(jìn)而用于合成乳脂肪三酰基甘油[10-11]。乳腺上皮細(xì)胞脂肪酸的合成主要由2種酶催化，ACC和FAS。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，添加乙酸鈉和丁酸鈉后，乳腺上皮細(xì)胞中ACC和FAS的表達(dá)顯著增加，在高峰期大約是未添加細(xì)胞的5～8倍。ACC是動(dòng)物體中調(diào)節(jié)脂肪酸合成的限速酶，與脂肪酸的從頭合成密切相關(guān),其活性在多個(gè)水平被調(diào)節(jié)。它的基因在兩個(gè)不同品系奶牛的泌乳期乳腺中表達(dá)不同[10]，表明這個(gè)基因在泌乳期脂肪酸合成中直接發(fā)揮作用。FAS它催化乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A而生成長(zhǎng)鏈FA。它由兩條相同的多肽組成，每條多肽有2500個(gè)氨基酸殘基和7個(gè)活性位點(diǎn)，具有功能活性的FAS以從頭到尾的昂表現(xiàn)為二聚體形式。FAS基因的表達(dá)直接影響著脂肪酸合成酶的多寡，對(duì)控制動(dòng)物體脂沉積有重要意義。乙酸鈉和丁酸鈉能夠增加兩種基因的表達(dá)，促進(jìn)組成乳脂重要的甘油三酯分別增加，進(jìn)而增強(qiáng)乳腺上皮細(xì)胞的泌乳能力。

本研究在乳腺上皮細(xì)胞中分別添加不同濃度的乙酸鈉和丁酸鈉，并通過(guò)RT-PCR方法檢測(cè)了乳脂肪酸合成關(guān)鍵基因ACC和FAS mRNA水平的表達(dá)變化，確定體外培養(yǎng)體系中調(diào)控乳脂肪酸合成的最佳乙酸鈉濃度為16 mmol/L，最佳丁酸鈉濃度為0.75 mmol/L，此時(shí)乳腺上皮細(xì)胞三?；视偷暮铣闪孔罡摺?/p>

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Influence on cow breast fatty acid biosynthesis related genes with sodium acetate and sodium butyrate

KONG Qing-yang，LIN Ye，LI Qing-zhang
(Northest Agricultural University,Harbin 150030,China)

Using fluorescence quantitative RT-PCR method,explored the effects of exogenous additives sodium acetate and sodium butyrate on gene expression of the key enzymes in milk fatty acid synthesis in mammary epithelial cells of dairy cow.And using semi-automatic biochemical analyzer detected the triacylglycerol concentration after adding sodium acetate and sodium butyrate in culture system,determined that the optimal sodium acetate was 16 mmol/L and sodium butyrate was 0.75 mmol/L regulating the biosynthesis of milk fat in vitro,provided a theoretical basis for artificial regulation of milk components.

sodium acetate;sodium butyrate;milk fatty acid synthesis；FAS；ACC

TS252.1

A

1001-2230（2012）03-0015-03

2011-10-18

國(guó)家高技術(shù)研究和發(fā)展863計(jì)劃（2006AA10Z1A4），東北農(nóng)業(yè)大學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)計(jì)劃（CXT005-1-1/2）。

孔慶洋（1986-）女，碩士，從事泌乳生物學(xué)與乳腺功能調(diào)控研究。

李慶章